Mae diagnosis gwahaniaethol o nodiwlau ysgyfeiniol a nodir gan tomograffeg gyfrifiadurol (CT) yn parhau i fod yn her mewn ymarfer clinigol.Yma, rydym yn nodweddu'r metabolome byd-eang o 480 o samplau serwm, gan gynnwys rheolaethau iach, nodiwlau ysgyfaint anfalaen, ac adenocarcinoma ysgyfaint cam I.Mae adenocarcinomas yn arddangos proffiliau metabolomig unigryw, tra bod gan nodiwlau anfalaen ac unigolion iach debygrwydd uchel mewn proffiliau metabolomig.Yn y grŵp darganfod (n = 306), nodwyd set o 27 metabolion i wahaniaethu rhwng nodiwlau anfalaen a malaen.AUC y model gwahaniaethol yn y grwpiau dilysu mewnol (n = 104) a dilysu allanol (n = 111) oedd 0.915 a 0.945, yn y drefn honno.Datgelodd dadansoddiad llwybr gynnydd mewn metabolion glycolytig sy'n gysylltiedig â gostyngiad mewn tryptoffan mewn serwm adenocarcinoma yr ysgyfaint o'i gymharu â nodiwlau anfalaen a rheolaethau iach, ac awgrymodd fod cymeriant tryptoffan yn hyrwyddo glycolysis mewn celloedd canser yr ysgyfaint.Mae ein hastudiaeth yn amlygu gwerth biofarcwyr metabolit serwm wrth asesu'r risg o nodiwlau ysgyfeiniol a ganfyddir gan CT.
Mae diagnosis cynnar yn hanfodol i wella cyfraddau goroesi ar gyfer cleifion canser.Mae canlyniadau Treial Sgrinio Canser yr Ysgyfaint Cenedlaethol yr Unol Daleithiau (NLST) ac Astudiaeth NELSON Ewropeaidd wedi dangos y gall sgrinio â thomograffeg gyfrifiadurol dos isel (LDCT) leihau marwolaethau canser yr ysgyfaint yn sylweddol mewn grwpiau risg uchel1,2,3.Ers y defnydd eang o LDCT ar gyfer sgrinio canser yr ysgyfaint, mae nifer yr achosion o ganfyddiadau radiograffig achlysurol o nodiwlau asymptomatig yr ysgyfaint wedi parhau i gynyddu 4 .Diffinnir nodiwlau pwlmonaidd fel didreiddedd ffocal hyd at 3 cm mewn diamedr 5 .Rydym yn wynebu anawsterau wrth asesu'r tebygolrwydd o falaenedd a delio â'r nifer fawr o nodiwlau ysgyfeiniol a ganfyddir yn achlysurol ar LDCT.Gall cyfyngiadau CT arwain at archwiliadau dilynol aml a chanlyniadau ffug-bositif, gan arwain at ymyrraeth ddiangen a gor-driniaeth6.Felly, mae angen datblygu biofarcwyr dibynadwy a defnyddiol i nodi canser yr ysgyfaint yn gywir yn y camau cynnar a gwahaniaethu rhwng y rhan fwyaf o nodiwlau anfalaen ar adeg canfod cychwynnol 7 .
Mae dadansoddiad moleciwlaidd cynhwysfawr o waed (serwm, plasma, celloedd mononiwclear gwaed ymylol), gan gynnwys genomeg, proteomeg neu methylation DNA8,9,10, wedi arwain at ddiddordeb cynyddol mewn darganfod biofarcwyr diagnostig ar gyfer canser yr ysgyfaint.Yn y cyfamser, mae dulliau metabolomeg yn mesur cynhyrchion terfynol cellog sy'n cael eu dylanwadu gan weithredoedd mewndarddol ac alldarddol ac felly'n cael eu cymhwyso i ragfynegi dyfodiad a chanlyniad afiechyd.Mae sbectrometreg màs cromatograffaeth hylif-tandem (LC-MS) yn ddull a ddefnyddir yn eang ar gyfer astudiaethau metabolomeg oherwydd ei sensitifrwydd uchel a'i ystod ddeinamig fawr, a all gwmpasu metabolion â gwahanol briodweddau ffisiogemegol11,12,13.Er bod dadansoddiad metabolomig byd-eang o blasma/serwm wedi'i ddefnyddio i nodi biomarcwyr sy'n gysylltiedig â diagnosis canser yr ysgyfaint14,15,16,17 ac effeithiolrwydd triniaeth,18 mae dosbarthwyr metabolit serwm i wahaniaethu rhwng nodiwlau anfalaen a malaen yr ysgyfaint i'w hastudio'n helaeth o hyd.- ymchwil enfawr.
Adenocarcinoma a charsinoma celloedd cennog yw'r ddau brif is-fath o ganser yr ysgyfaint celloedd nad ydynt yn fach (NSCLC).Mae profion sgrinio CT amrywiol yn nodi mai adenocarcinoma yw'r math histolegol mwyaf cyffredin o ganser yr ysgyfaint1,19,20,21.Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom ddefnyddio cromatograffaeth hylif tra-berfformiad-sbectrometreg màs cydraniad uchel (UPLC-HRMS) i berfformio dadansoddiad metabolomeg ar gyfanswm o 695 o samplau serwm, gan gynnwys rheolaethau iach, nodiwlau pwlmonaidd anfalaen, a ≤3 cm a ganfuwyd gan CT.Sgrinio ar gyfer adenocarsinoma yr ysgyfaint Cam I.Fe wnaethom nodi panel o fetabolion serwm sy'n gwahaniaethu adenocarcinoma yr ysgyfaint oddi wrth nodiwlau anfalaen a rheolaethau iach.Datgelodd dadansoddiad cyfoethogi llwybr fod metaboledd tryptoffan annormal a glwcos yn newidiadau cyffredin yn adenocarcinoma yr ysgyfaint o gymharu â nodiwlau anfalaen a rheolaethau iach.Yn olaf, fe wnaethom sefydlu a dilysu dosbarthwr metabolig serwm gyda phenodoldeb a sensitifrwydd uchel i wahaniaethu rhwng nodiwlau pwlmonaidd malaen ac anfalaen a ganfyddir gan LDCT, a allai gynorthwyo gyda diagnosis gwahaniaethol cynnar ac asesu risg.
Yn yr astudiaeth gyfredol, casglwyd samplau serwm sy'n cyfateb i ryw ac oedran yn ôl-weithredol o 174 o fesurau rheoli iach, 292 o gleifion â nodwlau pwlmonaidd anfalaen, a 229 o gleifion ag adenocarsinoma ysgyfaint cam I.Dangosir nodweddion demograffig y 695 o bynciau yn Nhabl Atodol 1.
Fel y dangosir yn Ffigur 1a, casglwyd cyfanswm o 480 o samplau serwm, gan gynnwys 174 rheolaeth iach (HC), 170 nodwlau anfalaen (BN), a 136 o samplau adenocarcinoma ysgyfaint cam I (LA), yng Nghanolfan Ganser Prifysgol Sun Yat-sen.Carfan ddarganfod ar gyfer proffilio metabolomig heb ei dargedu gan ddefnyddio cromatograffaeth hylif uwch-berfformiad - sbectrometreg màs cydraniad uchel (UPLC-HRMS).Fel y dangosir yn Ffigur Atodol 1, nodwyd metabolion gwahaniaethol rhwng ALl a HC, ALl a BN i sefydlu model dosbarthu ac archwilio dadansoddiad llwybr gwahaniaethol ymhellach.Cafodd 104 o samplau a gasglwyd gan Ganolfan Ganser Prifysgol Sun Yat-sen a 111 o samplau a gasglwyd gan ddau ysbyty arall eu dilysu'n fewnol ac yn allanol, yn y drefn honno.
poblogaeth Astudiaeth yn y garfan ddarganfod a gafodd ddadansoddiad metabolomeg serwm byd-eang gan ddefnyddio cromatograffaeth hylif uwch-berfformiad - sbectrometreg màs cydraniad uchel (UPLC-HRMS).b Dadansoddiad gwahaniaethol rhannol sgwariau lleiaf (PLS-DA) o gyfanswm y metabolome o 480 o samplau serwm o'r garfan astudio, gan gynnwys rheolaethau iach (HC, n = 174), nodwlau anfalaen (BN, n = 170), ac adenocarcinoma ysgyfaint cam I (Los Angeles, n = 136).+ESI, modd ionization electrospray positif, -ESI, modd ionization electrospray negyddol.c–e Dangosir metabolion gyda digonedd sylweddol wahanol mewn dau grŵp penodol (prawf rheng wedi'i lofnodi gan Wilcoxon dwy gynffon, cyfradd darganfod ffug gwerth p wedi'i addasu, FDR <0.05) mewn coch (newid plyg> 1.2) a glas (newid plyg < 0.83) .) a ddangosir ar y graffeg llosgfynydd.f Map gwres clystyru hierarchaidd yn dangos gwahaniaethau sylweddol yn nifer y metabolion anodedig rhwng LA a BN.Darperir data ffynhonnell ar ffurf ffeiliau data ffynhonnell.
Dadansoddwyd cyfanswm y metabolome serwm o 174 HC, 170 BN a 136 LA yn y grŵp darganfod gan ddefnyddio dadansoddiad UPLC-HRMS.Rydym yn dangos yn gyntaf fod samplau rheoli ansawdd (QC) yn clystyru'n dynn yng nghanol model dadansoddi prif gydrannau (PCA) heb oruchwyliaeth, gan gadarnhau sefydlogrwydd perfformiad yr astudiaeth gyfredol (Ffigur Atodol 2).
Fel y dangosir yn y dadansoddiad rhannol wahaniaethol sgwariau (PLS-DA) yn Ffigur 1 b, canfuom fod gwahaniaethau clir rhwng ALl a BN, LA a HC mewn moddau ïoneiddiad electrochwistrellu positif (+ESI) a negyddol (−ESI). .ynysig.Fodd bynnag, ni chanfuwyd unrhyw wahaniaethau arwyddocaol rhwng BN a HC mewn amodau +ESI a -ESI.
Gwelsom 382 o nodweddion gwahaniaethol rhwng ALl a HC, 231 o nodweddion gwahaniaethol rhwng ALl a BN, a 95 o nodweddion gwahaniaethol rhwng BN a HC (prawf rheng wedi'i lofnodi gan Wilcoxon, FDR <0.05 a newid lluosog >1.2 neu <0.83) (Ffigur .1c-e )..Cafodd brigau eu hanodi ymhellach (Data Atodol 3) yn erbyn cronfa ddata (mzCloud/HMDB/llyfrgell Chemspider) yn ôl gwerth m/z, amser cadw a darnio chwiliad sbectrwm torfol (manylion a ddisgrifir yn yr adran Dulliau) 22 .Yn olaf, nodwyd 33 a 38 o fetabolion anodedig gyda gwahaniaethau sylweddol mewn amlder ar gyfer ALl yn erbyn BN (Ffigur 1f a Thabl Atodol 2) ac ALl yn erbyn HC (Ffigur Atodol 3 a Thabl Atodol 2), yn y drefn honno.Mewn cyferbyniad, dim ond 3 metabolyn â gwahaniaethau sylweddol mewn digonedd a nodwyd yn BN a HC (Tabl Atodol 2), yn gyson â'r gorgyffwrdd rhwng BN a HC yn PLS-DA.Mae'r metabolion gwahaniaethol hyn yn cwmpasu ystod eang o fiocemegau (Ffigur Atodol 4).Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn dangos newidiadau sylweddol yn y metabolome serwm sy'n adlewyrchu trawsnewid malaen canser yr ysgyfaint cyfnod cynnar o'i gymharu â nodiwlau ysgyfaint anfalaen neu bynciau iach.Yn y cyfamser, mae tebygrwydd metabolome serwm BN a HC yn awgrymu y gall nodiwlau pwlmonaidd anfalaen rannu llawer o nodweddion biolegol ag unigolion iach.O ystyried bod treigladau genynnau derbynnydd ffactor twf epidermaidd (EGFR) yn gyffredin yn isdeip adenocarcinoma yr ysgyfaint 23, ceisiwyd canfod effaith treigladau gyrwyr ar y metabolome serwm.Yna dadansoddwyd proffil metabolomig cyffredinol 72 o achosion gyda statws EGFR yn y grŵp adenocarcinoma yr ysgyfaint.Yn ddiddorol, canfuom broffiliau tebyg rhwng cleifion mutant EGFR (n = 41) a chleifion math gwyllt EGFR (n = 31) mewn dadansoddiad PCA (Ffigur Atodol 5a).Fodd bynnag, fe wnaethom nodi 7 metabolyn yr oedd eu helaethrwydd wedi'i newid yn sylweddol mewn cleifion â threiglad EGFR o'i gymharu â chleifion â math EGFR gwyllt (prawf t, p < 0.05 a newid plyg> 1.2 neu < 0.83) (Ffigur Atodol 5b).Mae mwyafrif y metabolion hyn (5 allan o 7) yn acylcarnitinau, sy'n chwarae rhan bwysig mewn llwybrau ocsideiddio asid brasterog.
Fel y dangosir yn y llif gwaith a ddangosir yn Ffigur 2 a, cafwyd biofarcwyr ar gyfer dosbarthiad nodule gan ddefnyddio'r gweithredwyr crebachu lleiaf absoliwt a detholiad yn seiliedig ar 33 o fetabolion gwahaniaethol a nodwyd yn LA (n = 136) a BN (n = 170).Cyfuniad gorau o newidynnau (LASSO) – model atchweliad logistaidd deuaidd.Defnyddiwyd traws-ddilysiad deg gwaith i brofi dibynadwyedd y model.Mae dewis newidiol a rheoleiddio paramedr yn cael eu haddasu gan gosb uchafu tebygolrwydd gyda pharamedr λ24.Perfformiwyd dadansoddiad metabolomeg byd-eang ymhellach yn annibynnol yn y grwpiau dilysu mewnol (n = 104) a dilysu allanol (n = 111) i brofi perfformiad dosbarthiad y model gwahaniaethol.O ganlyniad, nodwyd 27 metabolion yn y set ddarganfod fel y model gwahaniaethol gorau gyda'r gwerth AUC cymedrig mwyaf (Ffig. 2b), ymhlith yr oedd 9 wedi cynyddu gweithgaredd a 18 wedi lleihau gweithgaredd yn ALl o gymharu â BN (Ffig. 2c).
Llif gwaith ar gyfer adeiladu dosbarthwr nodwlau pwlmonaidd, gan gynnwys dewis y panel gorau o fetabolion serwm yn y set ddarganfod gan ddefnyddio model atchweliad logistaidd deuaidd trwy groes-ddilysu deg gwaith a gwerthuso perfformiad rhagfynegol mewn setiau dilysu mewnol ac allanol.b Ystadegau traws-ddilysu model atchweliad LASSO ar gyfer dewis biomarcwyr metabolaidd.Mae'r niferoedd a roddir uchod yn cynrychioli nifer cyfartalog y biofarcwyr a ddewiswyd ar λ penodol.Mae'r llinell ddotiog goch yn cynrychioli gwerth cyfartalog AUC ar y lambda cyfatebol.Mae barrau gwall llwyd yn cynrychioli'r gwerthoedd AUC lleiaf ac uchaf.Mae'r llinell ddotiog yn nodi'r model gorau gyda'r 27 biofarcwr a ddewiswyd.AUC, ardal o dan gromlin nodwedd gweithredu'r derbynnydd (ROC).c Newidiadau plyg o 27 o fetabolion dethol yn y grŵp ALl o gymharu â'r grŵp BN yn y grŵp darganfod.Colofn goch – actifadu.Mae'r golofn las yn ddirywiad.d–f Cromliniau nodwedd gweithredu derbynnydd (ROC) sy'n dangos pŵer y model gwahaniaethol yn seiliedig ar 27 o gyfuniadau metabolyn yn y setiau dilysu mewnol, mewnol ac allanol.Darperir data ffynhonnell ar ffurf ffeiliau data ffynhonnell.
Crëwyd model rhagfynegi yn seiliedig ar gyfernodau atchweliad pwysol y 27 metabolyn hyn (Tabl Atodol 3).Cynhyrchodd dadansoddiad ROC yn seiliedig ar y 27 metabolion hyn ardal o dan y gromlin (AUC) gwerth 0.933, sensitifrwydd grŵp darganfod oedd 0.868, a phenodoldeb oedd 0.859 (Ffig. 2d).Yn y cyfamser, ymhlith y 38 o fetabolion gwahaniaethol anodedig rhwng ALl a HC, cyflawnodd set o 16 metabolyn AUC o 0.902 gyda sensitifrwydd o 0.801 a phenodoldeb o 0.856 wrth wahaniaethu rhwng ALl a HC (Ffigur Atodol 6a-c).Cymharwyd gwerthoedd AUC yn seiliedig ar drothwyon newid plyg gwahanol ar gyfer metabolion gwahaniaethol hefyd.Canfuom fod y model dosbarthu yn perfformio orau o ran gwahaniaethu rhwng ALl a BN (HC) pan osodwyd y lefel newid plyg i 1.2 yn erbyn 1.5 neu 2.0 (Ffigur Atodol 7a,b).Dilyswyd y model dosbarthu, yn seiliedig ar 27 o grwpiau metabolion, ymhellach mewn carfannau mewnol ac allanol.Yr AUC oedd 0.915 (sensitifrwydd 0.867, penodoldeb 0.811) ar gyfer dilysu mewnol a 0.945 (sensitifrwydd 0.810, penodoldeb 0.979) ar gyfer dilysu allanol (Ffig. 2e, f).Er mwyn asesu effeithlonrwydd rhyng-labordy, dadansoddwyd 40 sampl o'r garfan allanol mewn labordy allanol fel y disgrifir yn yr adran Dulliau.Cyflawnodd cywirdeb y dosbarthiad CDU o 0.925 (Ffigur Atodol 8).Gan mai carcinoma celloedd cennog yr ysgyfaint (LUSC) yw'r ail is-fath mwyaf cyffredin o ganser yr ysgyfaint celloedd nad ydynt yn fach (NSCLC) ar ôl adenocarcinoma'r ysgyfaint (LUAD), fe wnaethom hefyd brofi defnyddioldeb dilys proffiliau metabolaidd.BN ac 16 achos o LUSC.Roedd yr AUC o wahaniaethu rhwng LUSC a BN yn 0.776 (Ffigur Atodol 9), sy'n dangos gallu gwaeth o gymharu â gwahaniaethu rhwng LUAD a BN.
Mae astudiaethau wedi dangos bod cydberthynas gadarnhaol rhwng maint y nodules ar ddelweddau CT a'r tebygolrwydd o falaenedd ac mae'n parhau i fod yn brif benderfynydd triniaeth nodiwl25,26,27.Dangosodd dadansoddiad o ddata o'r garfan fawr o astudiaeth sgrinio NELSON fod y risg o falaenedd mewn pynciau â nodau <5 mm hyd yn oed yn debyg i'r risg mewn pynciau heb nodau 28 .Felly, y maint lleiaf sydd angen monitro CT yn rheolaidd yw 5 mm, fel yr argymhellir gan Gymdeithas Thorasig Prydain (BTS), a 6 mm, fel yr argymhellir gan Gymdeithas Fleischner 29 .Fodd bynnag, mae nodiwlau sy'n fwy na 6 mm a heb nodweddion anfalaen amlwg, a elwir yn nodiwlau pwlmonaidd amhenodol (IPN), yn parhau i fod yn her fawr o ran gwerthuso a rheoli mewn ymarfer clinigol30,31.Gwnaethom archwilio nesaf a oedd maint nodule yn dylanwadu ar lofnodion metabolomig gan ddefnyddio samplau cyfun o'r carfannau darganfod a dilysu mewnol.Gan ganolbwyntio ar 27 o fiofarcwyr dilys, gwnaethom gymharu proffiliau PCA metabolomau is-6 mm HC a BN yn gyntaf.Canfuom fod y rhan fwyaf o'r pwyntiau data ar gyfer HC a BN yn gorgyffwrdd, gan ddangos bod lefelau metabolion serwm yn debyg yn y ddau grŵp (Ffig. 3a).Roedd y mapiau nodwedd ar draws ystodau maint gwahanol yn parhau i gael eu cadw yn BN ac LA (Ffig. 3b, c), tra gwelwyd gwahaniad rhwng nodiwlau malaen ac anfalaen yn yr ystod 6-20 mm (Ffig. 3d).Roedd gan y garfan hon AUC o 0.927, penodolrwydd o 0.868, a sensitifrwydd o 0.820 ar gyfer rhagfynegi malaenedd nodwlau yn mesur 6 i 20 mm (Ffig. 3e, f).Mae ein canlyniadau'n dangos y gall y dosbarthwr ddal newidiadau metabolaidd a achosir gan drawsnewidiad malaen cynnar, waeth beth fo maint y nodule.
ad Cymharu proffiliau PCA rhwng grwpiau penodedig yn seiliedig ar ddosbarthwr metabolaidd o 27 metabolion.CC a BN < 6 mm.b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm.yn ALl 6–20 mm yn erbyn ALl 20–30 mm.g BN 6–20 mm ac ALl 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;ALl 6–20 mm, n = 89;ALl 20–30 mm, n = 77. e Cromlin nodwedd weithredu'r derbynnydd (ROC) yn dangos perfformiad model gwahaniaethol ar gyfer nodiwlau 6–20 mm.f Cyfrifwyd gwerthoedd tebygolrwydd yn seiliedig ar y model atchweliad logistaidd ar gyfer nodiwlau yn mesur 6–20 mm.Mae'r llinell ddotiog lwyd yn cynrychioli'r gwerth terfyn gorau posibl (0.455).Mae'r niferoedd uchod yn cynrychioli canran yr achosion a ragwelir ar gyfer Los Angeles.Defnyddiwch brawf t Myfyriwr dwy gynffon.PCA, dadansoddi prif gydrannau.Ardal AUC o dan y gromlin.Darperir data ffynhonnell ar ffurf ffeiliau data ffynhonnell.
Dewiswyd pedwar sampl (44-61 oed) gyda meintiau nodwl pwlmonaidd tebyg (7-9 mm) ymhellach i ddangos perfformiad y model rhagfynegi malaenedd arfaethedig (Ffig. 4a, b).Ar y sgrinio cychwynnol, cyflwynodd Achos 1 fel nodwl solet gyda chalchiad, nodwedd sy'n gysylltiedig â natur ddiniwed, tra bod Achos 2 yn cael ei gyflwyno fel nodwl rhannol solet amhenodol heb unrhyw nodweddion anfalaen amlwg.Dangosodd tair rownd o sganiau CT dilynol fod yr achosion hyn wedi aros yn sefydlog dros gyfnod o 4 blynedd ac felly'n cael eu hystyried yn nodiwlau anfalaen (Ffig. 4a).O'i gymharu â gwerthusiad clinigol o sganiau CT cyfresol, nododd dadansoddiad metabolit serwm un ergyd gyda'r model dosbarthwr presennol yn gyflym ac yn gywir y nodwlau anfalaen hyn yn seiliedig ar gyfyngiadau tebygol (Tabl 1).Mae Ffigur 4b yn achos 3 yn dangos nodwl ag arwyddion o dynnu pliwrol yn ôl, a gysylltir amlaf â malaenedd32.Achos 4 wedi'i gyflwyno fel nodwl rhannol solet amhenodol heb unrhyw dystiolaeth o achos anfalaen.Rhagfynegwyd yr holl achosion hyn fel rhai malaen yn ôl y model dosbarthwr (Tabl 1).Dangoswyd asesiad o adenocarcinoma yr ysgyfaint gan archwiliad histopatholegol ar ôl llawdriniaeth echdoriad yr ysgyfaint (Ffig. 4b).Ar gyfer y set dilysu allanol, rhagfynegodd y dosbarthwr metabolaidd ddau achos o nodiwlau ysgyfaint amhenodol yn fwy na 6 mm yn gywir (Ffigur Atodol 10).
Delweddau CT o ffenestr echelinol yr ysgyfaint o ddau achos o nodiwlau anfalaen.Yn achos 1, dangosodd sgan CT ar ôl 4 blynedd nodwl solet sefydlog yn mesur 7 mm gyda chalchiad yn y llabed isaf dde.Yn achos 2, datgelodd sgan CT ar ôl 5 mlynedd nodwl sefydlog, rhannol solet gyda diamedr o 7 mm yn y llabed uchaf dde.b Delweddau CT ffenestr echelinol o'r ysgyfaint ac astudiaethau patholegol cyfatebol o ddau achos o adenocarcinoma cam I cyn echdoriad yr ysgyfaint.Datgelodd achos 3 nodwl gyda diamedr o 8 mm yn y llabed uchaf dde gyda thynnu plewrol yn ôl.Datgelodd achos 4 nodwl gwydr daear rhannol solet yn mesur 9 mm yn y llabed uchaf ar y chwith.Staeniad hematocsilin ac eosin (H&E) o feinwe'r ysgyfaint wedi'i echdynu (bar graddfa = 50 μm) gan ddangos patrwm twf acinar adenocarcinoma'r ysgyfaint.Mae saethau'n nodi nodiwlau a ganfuwyd ar ddelweddau CT.Mae delweddau H&E yn ddelweddau cynrychioliadol o feysydd microsgopig lluosog (>3) a archwiliwyd gan y patholegydd.
Gyda'i gilydd, mae ein canlyniadau'n dangos gwerth posibl biomarcwyr metabolit serwm yn y diagnosis gwahaniaethol o nodiwlau ysgyfeiniol, a allai fod yn her wrth werthuso sgrinio CT.
Yn seiliedig ar banel metabolyn gwahaniaethol dilys, ceisiwyd nodi cydberthynasau biolegol newidiadau metabolaidd mawr.Nododd dadansoddiad cyfoethogi llwybr KEGG gan MetaboAnalyst 6 llwybr cyffredin a newidiwyd yn sylweddol rhwng y ddau grŵp penodol (ALl vs HC ac LA vs. BN, wedi'i addasu p ≤ 0.001, effaith > 0.01).Nodweddwyd y newidiadau hyn gan aflonyddwch mewn metaboledd pyruvate, metaboledd tryptoffan, metaboledd niacin a nicotinamid, glycolysis, y cylch TCA, a metaboledd purin (Ffig. 5a).Yna fe wnaethom berfformio metabolomeg wedi'i dargedu ymhellach i wirio newidiadau mawr gan ddefnyddio meintioli absoliwt.Pennu metabolion cyffredin mewn llwybrau a newidir yn gyffredin gan sbectrometreg màs pedwarplyg triphlyg (QQQ) gan ddefnyddio safonau metabolyn dilys.Mae nodweddion demograffig sampl targed yr astudiaeth metabolomeg wedi'u cynnwys yn Nhabl Atodol 4. Yn gyson â'n canlyniadau metabolomeg byd-eang, cadarnhaodd dadansoddiad meintiol fod hypoxanthine a xanthine, pyruvate, a lactate yn cynyddu yn ALl o'i gymharu â BN a HC (Ffig. 5b, c, p <0.05).Fodd bynnag, ni chanfuwyd unrhyw wahaniaethau arwyddocaol yn y metabolion hyn rhwng BN a HC.
Dadansoddiad cyfoethogi llwybr KEGG o fetabolion sylweddol wahanol yn y grŵp ALl o gymharu â'r grwpiau BN a HC.Defnyddiwyd Globaltest dwy gynffon, ac addaswyd gwerthoedd p gan ddefnyddio dull Holm-Bonferroni (wedi'i addasu p ≤ 0.001 a maint effaith > 0.01).b–d Plotiau ffidil yn dangos lefelau hypoxanthine, xanthine, lactad, pyruvate, a tryptoffan mewn serwm HC, BN, ac LA a bennir gan LC-MS/MS (n = 70 y grŵp).Mae llinellau doredig gwyn a du yn dynodi'r canolrif a'r chwartel, yn y drefn honno.e Plot ffidil yn dangos mynegiant mRNA Log2TPM normaleiddio (trawsgrifiadau fesul miliwn) o SLC7A5 a QPRT mewn adenocarcinoma yr ysgyfaint (n = 513) o gymharu â meinwe ysgyfaint arferol (n = 59) yn y set ddata LUAD-TCGA.Mae'r blwch gwyn yn cynrychioli'r amrediad rhyngchwartel, mae'r llinell ddu lorweddol yn y canol yn cynrychioli'r canolrif, ac mae'r llinell ddu fertigol sy'n ymestyn o'r blwch yn cynrychioli'r cyfwng hyder 95% (CI).f Plot cydberthynas Pearson o fynegiant SLC7A5 a GAPDH yn adenocarcinoma yr ysgyfaint (n = 513) a meinwe ysgyfaint arferol (n = 59) yn set ddata TCGA.Mae'r ardal lwyd yn cynrychioli'r CI o 95%.r, cyfernod cydberthynas Pearson.g Lefelau tryptoffan cellog normaleiddio mewn celloedd A549 wedi'u trawslifo â rheolaeth shRNA amhenodol (NC) a shSLC7A5 (Sh1, Sh2) a bennir gan LC-MS/MS.Cyflwynir dadansoddiad ystadegol o bum sampl biolegol annibynnol ym mhob grŵp.h Lefelau cellog NADt (cyfanswm NAD, gan gynnwys NAD+ a NADH) yng nghelloedd A549 (NC) a SLC7A5 yn dymchwel celloedd A549 (Sh1, Sh2).Cyflwynir dadansoddiad ystadegol o dri sampl biolegol annibynnol ym mhob grŵp.i Mesurwyd gweithgaredd glycolytig celloedd A549 cyn ac ar ôl dymchweliad SLC7A5 yn ôl cyfradd asideiddio allgellog (ECAR) (n = 4 sampl fiolegol annibynnol fesul grŵp).2-DG, 2-deoxy-D-glwcos.Defnyddiwyd prawf t Myfyriwr dwy gynffon yn (b–h).Yn (g–i), mae bariau gwall yn cynrychioli'r cymedr ± SD, perfformiwyd pob arbrawf dair gwaith yn annibynnol ac roedd y canlyniadau'n debyg.Darperir data ffynhonnell ar ffurf ffeiliau data ffynhonnell.
O ystyried effaith sylweddol newid metaboledd tryptoffan yn y grŵp ALl, fe wnaethom hefyd asesu lefelau tryptoffan serwm yn y grwpiau HC, BN, ac ALl gan ddefnyddio QQQ.Canfuom fod serwm tryptoffan wedi’i leihau yn ALl o gymharu â HC neu BN (p < 0.001, Ffigur 5d), sy’n gyson â chanfyddiadau blaenorol bod lefelau tryptoffan cylchredeg yn is mewn cleifion â chanser yr ysgyfaint nag mewn rheolaethau iach o’r grŵp rheoli33,34 ,35.Canfu astudiaeth arall a ddefnyddiodd olrheiniwr PET/CT 11C-methyl-L-tryptoffan fod yr amser cadw signal tryptoffan ym meinwe canser yr ysgyfaint wedi cynyddu’n sylweddol o gymharu â briwiau anfalaen neu feinwe arferol36.Rydym yn rhagdybio y gallai'r gostyngiad mewn tryptoffan mewn serwm ALl adlewyrchu'r defnydd o dryptoffan gweithredol gan gelloedd canser yr ysgyfaint.
Mae'n hysbys hefyd mai cynnyrch terfynol y llwybr kynurenine o gataboledd tryptoffan yw NAD+37,38, sy'n swbstrad pwysig ar gyfer adwaith glyseraldehyde-3-ffosffad â 1,3-bisphosphoglycerate mewn glycolysis39.Er bod astudiaethau blaenorol wedi canolbwyntio ar rôl cataboliaeth tryptoffan mewn rheoleiddio imiwnedd, ceisiwyd egluro'r cydadwaith rhwng dadreoleiddio tryptoffan a llwybrau glycolytig a welwyd yn yr astudiaeth gyfredol.Gwyddys bod teulu cludwr hydoddyn 7 aelod 5 (SLC7A5) yn gludwr tryptoffan43,44,45.Mae asid quinolinic phosphoribosyltransferase (QPRT) yn ensym sydd wedi'i leoli i lawr yr afon o'r llwybr kynurenine sy'n trosi asid cwinolinig i NAMN46.Datgelodd archwiliad o set ddata LUAD TCGA fod SLC7A5 a QPRT wedi'u huwchreoleiddio'n sylweddol mewn meinwe tiwmor o'i gymharu â meinwe arferol (Ffig. 5e).Gwelwyd y cynnydd hwn yng nghamau I a II yn ogystal â chamau III a IV o adenocarcinoma yr ysgyfaint (Ffigur Atodol 11), sy'n nodi aflonyddwch cynnar mewn metaboledd tryptoffan sy'n gysylltiedig â tumorigenesis.
Yn ogystal, dangosodd set ddata LUAD-TCGA gydberthynas gadarnhaol rhwng mynegiant mRNA SLC7A5 a GAPDH mewn samplau cleifion canser (r = 0.45, p = 1.55E-26, Ffigur 5f).Mewn cyferbyniad, ni chanfuwyd unrhyw gydberthynas arwyddocaol rhwng llofnodion genynnau o'r fath ym meinwe arferol yr ysgyfaint (r = 0.25, p = 0.06, Ffigur 5f).Gostyngodd dymchweliad SLC7A5 (Ffigur Atodol 12) mewn celloedd A549 yn sylweddol lefelau tryptoffan cellog a NAD(H) (Ffigur 5g,h), gan arwain at weithgaredd glycolytig gwanedig fel y'i mesurwyd gan gyfradd asideiddio allgellog (ECAR) (Ffigur 1).5i).Felly, yn seiliedig ar newidiadau metabolaidd mewn serwm a chanfod in vitro, rydym yn rhagdybio y gallai metaboledd tryptoffan gynhyrchu NAD + trwy'r llwybr kywrenin a chwarae rhan bwysig wrth hyrwyddo glycolysis mewn canser yr ysgyfaint.
Mae astudiaethau wedi dangos y gallai nifer fawr o nodiwlau ysgyfeiniol amhenodol a ganfyddir gan LDCT arwain at yr angen am brofion ychwanegol megis PET-CT, biopsi ysgyfaint, a gor-driniaeth oherwydd diagnosis ffug-positif o falaenedd.31 Fel y dangosir yn Ffigur 6, nododd ein hastudiaeth banel o fetabolion serwm gyda gwerth diagnostig posibl a allai wella haeniad risg a rheolaeth ddilynol o nodiwlau pwlmonaidd a ganfyddir gan CT.
Mae nodau pwlmonaidd yn cael eu gwerthuso gan ddefnyddio tomograffeg gyfrifiadurol dos isel (LDCT) gyda nodweddion delweddu sy'n awgrymu achosion anfalaen neu falaen.Gall canlyniad ansicr nodiwlau arwain at ymweliadau dilynol aml, ymyriadau diangen, a gor-driniaeth.Gallai cynnwys dosbarthwyr metabolaidd serwm gyda gwerth diagnostig wella asesu risg a rheolaeth ddilynol o nodiwlau ysgyfeiniol.Tomograffeg allyriadau positron PET.
Mae data o astudiaeth NLST yr Unol Daleithiau ac astudiaeth NELSON Ewropeaidd yn awgrymu y gallai sgrinio grwpiau risg uchel â thomograffeg gyfrifiadurol dos isel (LDCT) leihau marwolaethau o ganser yr ysgyfaint1,3.Fodd bynnag, asesiad risg a rheolaeth glinigol ddilynol o niferoedd mawr o nodiwlau pwlmonaidd achlysurol a ganfuwyd gan LDCT yw'r rhai mwyaf heriol o hyd.Y prif nod yw optimeiddio dosbarthiad cywir protocolau LDCT presennol trwy ymgorffori biofarcwyr dibynadwy.
Mae rhai biomarcwyr moleciwlaidd, megis metabolion gwaed, wedi'u nodi trwy gymharu canser yr ysgyfaint â rheolaethau iach15,17.Yn yr astudiaeth gyfredol, fe wnaethom ganolbwyntio ar gymhwyso dadansoddiad metabolomeg serwm i wahaniaethu rhwng nodiwlau pwlmonaidd anfalaen a malaen a ganfyddir yn ddamweiniol gan LDCT.Cymharwyd y metabolome serwm byd-eang o reolaeth iach (HC), nodules ysgyfaint anfalaen (BN), a samplau adenocarcinoma ysgyfaint cam I (LA) gan ddefnyddio dadansoddiad UPLC-HRMS.Canfuom fod gan HC a BN broffiliau metabolaidd tebyg, tra dangosodd ALl newidiadau sylweddol o gymharu â HC a BN.Fe wnaethom nodi dwy set o fetabolion serwm sy'n gwahaniaethu LA oddi wrth HC a BN.
Mae'r cynllun adnabod presennol sy'n seiliedig ar LDCT ar gyfer nodiwlau anfalaen a malaen yn seiliedig yn bennaf ar faint, dwysedd, morffoleg a chyfradd twf nodiwlau dros amser30.Mae astudiaethau blaenorol wedi dangos bod cysylltiad agos rhwng maint y nodules a'r tebygolrwydd o ganser yr ysgyfaint.Hyd yn oed mewn cleifion risg uchel, y risg o falaenedd mewn nodau <6 mm yw <1%.Mae'r risg o falaenedd ar gyfer nodiwlau sy'n mesur 6 i 20 mm yn amrywio o 8% i 64%30.Felly, mae Cymdeithas Fleischner yn argymell diamedr toriad o 6 mm ar gyfer dilyniant CT arferol.29 Fodd bynnag, nid yw asesu risg a rheoli nodiwlau pwlmonaidd amhenodol (IPN) sy'n fwy na 6 mm wedi'u cyflawni'n ddigonol 31 .Mae rheolaeth bresennol clefyd cynhenid y galon fel arfer yn seiliedig ar aros yn wyliadwrus gyda monitro CT yn aml.
Yn seiliedig ar y metabolom dilys, fe wnaethom ddangos am y tro cyntaf y gorgyffwrdd o lofnodion metabolomig rhwng unigolion iach a nodiwlau anfalaen <6 mm.Mae'r tebygrwydd biolegol yn gyson â chanfyddiadau CT blaenorol bod y risg o falaenedd ar gyfer nodiwlau <6 mm mor isel ag ar gyfer pynciau heb nodau.30 Dylid nodi bod ein canlyniadau hefyd yn dangos bod gan nodiwlau anfalaen <6 mm a ≥6 mm uchel. tebygrwydd mewn proffiliau metabolomig, sy'n awgrymu bod y diffiniad swyddogaethol o etioleg anfalaen yn gyson waeth beth fo maint y nodule.Felly, gall paneli metabolit serwm diagnostig modern ddarparu un assay fel prawf diystyru pan ganfyddir nodiwlau i ddechrau ar CT ac o bosibl leihau monitro cyfresol.Ar yr un pryd, roedd yr un panel o fiofarcwyr metabolaidd yn gwahaniaethu rhwng nodiwlau malaen ≥6 mm o ran maint o nodiwlau anfalaen ac yn darparu rhagfynegiadau cywir ar gyfer IPNs o faint tebyg a nodweddion morffolegol amwys ar ddelweddau CT.Perfformiodd y dosbarthwr metaboledd serwm hwn yn dda wrth ragweld malaenedd nodules ≥6 mm gydag AUC o 0.927.Gyda'i gilydd, mae ein canlyniadau'n dangos y gall llofnodion metabolomig serwm unigryw adlewyrchu'n benodol newidiadau metabolaidd cynnar a achosir gan tiwmor a bod â gwerth posibl fel rhagfynegwyr risg, yn annibynnol ar faint nodule.
Yn nodedig, adenocarcinoma yr ysgyfaint (LUAD) a charsinoma celloedd cennog (LUSC) yw'r prif fathau o ganser yr ysgyfaint celloedd nad ydynt yn fach (NSCLC).O ystyried bod LUSC wedi'i gysylltu'n gryf â defnyddio tybaco47 a LUAD yw'r histoleg fwyaf cyffredin o nodiwlau ysgyfaint damweiniol a ganfuwyd ar sgrinio CT48, adeiladwyd ein model dosbarthwr yn benodol ar gyfer samplau adenocarcinoma cam I.Canolbwyntiodd Wang a’i gydweithwyr hefyd ar LUAD a nododd naw llofnod lipid gan ddefnyddio lipidomeg i wahaniaethu rhwng canser yr ysgyfaint cyfnod cynnar ac unigolion iach17.Fe wnaethon ni brofi'r model dosbarthwr presennol ar 16 achos o LUSC cam I a 74 nodwlau anfalaen a gwelsom gywirdeb rhagfynegiad LUSC isel (AUC 0.776), sy'n awgrymu y gallai fod gan LUAD a LUSC eu llofnodion metabolomig eu hunain.Yn wir, dangoswyd bod LUAD a LUSC yn amrywio o ran etioleg, tarddiad biolegol ac aberrations genetig49.Felly, dylid cynnwys mathau eraill o histoleg mewn modelau hyfforddi ar gyfer canfod canser yr ysgyfaint ar sail poblogaeth mewn rhaglenni sgrinio.
Yma, gwnaethom nodi'r chwe llwybr a newidiwyd amlaf mewn adenocarcinoma yr ysgyfaint o gymharu â rheolaethau iach a nodiwlau anfalaen.Mae Xanthine a hypoxanthine yn fetabolion cyffredin o'r llwybr metabolig purine.Yn gyson â'n canlyniadau, cynyddwyd canolradd sy'n gysylltiedig â metaboledd purin yn sylweddol yn serwm neu feinweoedd cleifion ag adenocarcinoma yr ysgyfaint o'i gymharu â rheolaethau iach neu gleifion yn y cam cyn-ymledol15,50.Gall lefelau uwch o serwm xanthine a hypoxanthine adlewyrchu'r anaboliaeth sy'n ofynnol gan gelloedd canser sy'n amlhau'n gyflym.Mae dadreoleiddio metaboledd glwcos yn nodwedd adnabyddus o fetaboledd canser51.Yma, gwelsom gynnydd sylweddol mewn pyruvate a lactad yn y grŵp ALl o'i gymharu â'r grŵp HC a BN, sy'n gyson ag adroddiadau blaenorol o annormaleddau llwybr glycolytig ym mhroffiliau metabolome serwm cleifion canser yr ysgyfaint celloedd nad ydynt yn fach (NSCLC) a rheolaethau iach.mae'r canlyniadau'n gyson52,53.
Yn bwysig, gwelsom gydberthynas wrthdro rhwng pyruvate a metabolaeth tryptoffan yn serwm adenocarcinomas yr ysgyfaint.Gostyngwyd lefelau serwm tryptoffan yn y grŵp ALl o gymharu â'r grŵp HC neu BN.Yn ddiddorol, canfu astudiaeth flaenorol ar raddfa fawr yn defnyddio carfan arfaethedig fod lefelau isel o dryptoffan cylchredol yn gysylltiedig â risg uwch o ganser yr ysgyfaint 54 .Mae tryptoffan yn asid amino hanfodol a gawn yn gyfan gwbl o fwyd.Rydym yn dod i'r casgliad y gall dirywiad serwm tryptoffan yn adenocarcinoma yr ysgyfaint adlewyrchu disbyddiad cyflym o'r metabolit hwn.Mae'n hysbys iawn mai cynnyrch terfynol cataboliaeth tryptoffan trwy'r llwybr kynurenine yw ffynhonnell synthesis de novo NAD+.Oherwydd bod NAD+ yn cael ei gynhyrchu'n bennaf drwy'r llwybr achub, mae pwysigrwydd NAD+ ym metabolaeth tryptoffan mewn iechyd a chlefydau i'w benderfynu o hyd46.Dangosodd ein dadansoddiad o gronfa ddata TCGA fod mynegiant y cludwr hydoddyn cludo tryptoffan 7A5 (SLC7A5) wedi cynyddu'n sylweddol yn adenocarcinoma yr ysgyfaint o'i gymharu â rheolaethau arferol a'i fod yn cydberthyn yn gadarnhaol â mynegiant yr ensym glycolytig GAPDH.Mae astudiaethau blaenorol wedi canolbwyntio'n bennaf ar rôl cataboliaeth tryptoffan wrth atal yr ymateb imiwn gwrth-tiwmor40,41,42.Yma rydym yn dangos bod ataliad rhag cymryd tryptoffan trwy ddymchwel SLC7A5 mewn celloedd canser yr ysgyfaint yn arwain at ostyngiad dilynol mewn lefelau NAD cellog a gwanhad cydredol o weithgaredd glycolytig.I grynhoi, mae ein hastudiaeth yn darparu sail fiolegol ar gyfer newidiadau mewn metaboledd serwm sy'n gysylltiedig â thrawsnewidiad malaen o adenocarcinoma yr ysgyfaint.
Treigladau EGFR yw'r treigladau gyrrwr mwyaf cyffredin mewn cleifion â NSCLC.Yn ein hastudiaeth, canfuom fod gan gleifion â threiglad EGFR (n = 41) broffiliau metabolomig cyffredinol tebyg i gleifion ag EGFR math gwyllt (n = 31), er i ni ddod o hyd i lefelau serwm gostyngol rhai cleifion mutant EGFR mewn cleifion acylcarnitin.Swyddogaeth sefydledig acylcarnitinau yw cludo grwpiau acyl o'r cytoplasm i'r matrics mitocondriaidd, gan arwain at ocsidiad asidau brasterog i gynhyrchu egni 55 .Yn gyson â'n canfyddiadau, nododd astudiaeth ddiweddar hefyd broffiliau metabolome tebyg rhwng tiwmorau tebyg i EGFR mutant ac EGFR trwy ddadansoddi metabolom byd-eang 102 o samplau meinwe adenocarcinoma yr ysgyfaint50.Yn ddiddorol, canfuwyd cynnwys acylcarnitin hefyd yn y grŵp mutant EGFR.Felly, gallai p'un a yw newidiadau mewn lefelau acylcarnitin yn adlewyrchu newidiadau metabolaidd a achosir gan EGFR a'r llwybrau moleciwlaidd sylfaenol yn haeddu astudiaeth bellach.
I gloi, mae ein hastudiaeth yn sefydlu dosbarthwr metabolig serwm ar gyfer diagnosis gwahaniaethol o nodiwlau ysgyfeiniol ac yn cynnig llif gwaith a all optimeiddio asesiad risg a hwyluso rheolaeth glinigol yn seiliedig ar sgrinio sgan CT.
Cymeradwywyd yr astudiaeth hon gan Bwyllgor Moeseg Ysbyty Canser Prifysgol Sun Yat-sen, Ysbyty Cysylltiedig Cyntaf Prifysgol Sun Yat-sen, a Phwyllgor Moeseg Ysbyty Canser Prifysgol Zhengzhou.Yn y grwpiau darganfod a dilysu mewnol, casglwyd 174 sera gan unigolion iach a 244 sera o nodiwlau anfalaen gan unigolion sy'n cael archwiliadau meddygol blynyddol yn yr Adran Rheoli ac Atal Canser, Canolfan Ganser Prifysgol Sun Yat-sen, a 166 nodwlau anfalaen.serwm.Casglwyd adenocarcinomas ysgyfaint cam I o Ganolfan Ganser Prifysgol Sun Yat-sen.Yn y garfan ddilysu allanol, roedd 48 achos o nodiwlau anfalaen, 39 achos o adenocarcinoma ysgyfaint cam I o Ysbyty Cysylltiedig Cyntaf Prifysgol Sun Yat-sen, a 24 achos o adenocarcinoma ysgyfaint cam I o Ysbyty Canser Zhengzhou.Casglodd Canolfan Ganser Prifysgol Sun Yat-sen hefyd 16 achos o ganser yr ysgyfaint celloedd cennog cam I i brofi gallu diagnostig y dosbarthwr metabolaidd sefydledig (dangosir nodweddion cleifion yn Nhabl Atodol 5).Casglwyd samplau o’r garfan ddarganfod a’r garfan ddilysu fewnol rhwng Ionawr 2018 a Mai 2020. Casglwyd samplau ar gyfer y garfan ddilysu allanol rhwng Awst 2021 a Hydref 2022. Er mwyn lleihau rhagfarn rhywedd, neilltuwyd tua’r un nifer o achosion gwrywaidd a benywaidd i bob un. carfan.Tîm Darganfod a Thîm Adolygu Mewnol.Pennwyd rhyw y cyfranogwr yn seiliedig ar hunan-adroddiad.Cafwyd caniatâd gwybodus gan yr holl gyfranogwyr ac ni ddarparwyd unrhyw iawndal.Y pynciau â nodwlau anfalaen oedd y rhai â sgôr sgan CT sefydlog o 2 i 5 mlynedd ar adeg y dadansoddiad, ac eithrio 1 achos o'r sampl dilysu allanol, a gasglwyd cyn llawdriniaeth a'i ddiagnosio gan histopatholeg.Ac eithrio broncitis cronig.Casglwyd achosion o adenocarcinoma yr ysgyfaint cyn echdoriad yr ysgyfaint a'u cadarnhau gan ddiagnosis patholegol.Casglwyd samplau gwaed ymprydio mewn tiwbiau gwahanu serwm heb unrhyw wrthgeulyddion.Cafodd samplau gwaed eu ceulo am 1 awr ar dymheredd yr ystafell ac yna eu hallgyrchu ar 2851 × g am 10 munud ar 4°C i gasglu uwchnatur serwm.Cafodd aliquots serwm eu rhewi ar -80 ° C nes echdynnu metabolion.Casglodd yr Adran Atal Canser ac Archwiliad Meddygol o Ganolfan Ganser Prifysgol Sun Yat-sen gronfa o serwm gan 100 o roddwyr iach, gan gynnwys nifer cyfartal o ddynion a menywod rhwng 40 a 55 oed.Roedd cyfeintiau cyfartal o bob sampl rhoddwr yn gymysg, a chafodd y gronfa a ddeilliodd ohono ei ddosbarthu a'i storio ar -80°C.Defnyddiwyd y gymysgedd serwm fel deunydd cyfeirio ar gyfer rheoli ansawdd a safoni data.
Dadmer serwm cyfeirio a samplau prawf a chafodd metabolion eu tynnu gan ddefnyddio dull echdynnu cyfun (MTBE/methanol/dŵr) 56 .Yn gryno, cymysgwyd 50 μl o serwm â 225 μl o fethanol oer-iâ a 750 μl o ether methyl tert-butyl oer-iâ (MTBE).Trowch y cymysgedd a deorwch ar rew am 1 awr.Yna cymysgwyd y samplau a chymysgwyd fortecs â 188 μl o ddŵr gradd MS yn cynnwys safonau mewnol (13C-lactad, 13C3-pyruvate, 13C-methionine, a 13C6-isoleucine, a brynwyd o Cambridge Isotop Laboratories).Yna cafodd y cymysgedd ei allgyrchu ar 15,000 × g am 10 munud ar 4 ° C, a throsglwyddwyd y cam isaf yn ddau diwb (125 μL yr un) ar gyfer dadansoddiad LC-MS mewn moddau cadarnhaol a negyddol.Yn olaf, anweddwyd y sampl i sychder mewn crynodwr gwactod cyflym.
Cafodd y metabolion sych eu hailgyfansoddi mewn 120 μl o acetonitrile 80%, eu fortecs am 5 munud, a'u centrifugio ar 15,000 × g am 10 munud ar 4 ° C.Trosglwyddwyd supernatants i ffiolau gwydr ambr gyda microinserts ar gyfer astudiaethau metabolomeg.Dadansoddiad metabolomeg heb ei dargedu ar lwyfan cromatograffaeth hylif tra-berfformiad - sbectrometreg màs cydraniad uchel (UPLC-HRMS).Gwahanwyd metabolion gan ddefnyddio system Dionex Ultimate 3000 UPLC a cholofn ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters).Yn y modd ïon positif, y cyfnodau symudol oedd 95% (A) a 50% acetonitrile (B), pob un yn cynnwys 10 mmol/L amoniwm asetad a 0.1% asid fformig.Mewn modd negyddol, roedd cyfnodau symudol A a B yn cynnwys 95% a 50% acetonitrile, yn y drefn honno, roedd y ddau gyfnod yn cynnwys 10 mmol/L amoniwm asetad, pH = 9. Roedd y rhaglen graddiant fel a ganlyn: 0–0.5 mun, 2% B;0.5–12 mun, 2–50% B;12–14 mun, 50–98% B;14–16 mun, 98% B;16–16.1.min, 98 –2% B;16.1–20 mun, 2% B. Cadwyd y golofn ar 40°C a'r sampl ar 10°C yn yr awtsampler.Y gyfradd llif oedd 0.3 ml/munud, cyfaint y pigiad oedd 3 μl.Gweithredwyd sbectromedr màs Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) gyda ffynhonnell ionization electrospray (ESI) yn y modd sgan llawn ac ynghyd â modd monitro ddMS2 i gasglu llawer iawn o ddata.Gosodwyd y paramedrau MS fel a ganlyn: foltedd chwistrellu +3.8 kV / - 3.2 kV, tymheredd capilari 320 ° C, nwy cysgodi 40 arb, nwy ategol 10 arb, tymheredd gwresogydd stiliwr 350 ° C, ystod sganio 70-1050 m / h, penderfyniad.70 000. Cafwyd data gan ddefnyddio Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Er mwyn asesu ansawdd data, cynhyrchwyd samplau rheoli ansawdd cyfun (QC) trwy dynnu aliquots 10 μL o'r uwchnatant o bob sampl.Dadansoddwyd chwe chwistrelliad sampl rheoli ansawdd ar ddechrau'r dilyniant dadansoddol i asesu sefydlogrwydd y system UPLC-MS.Yna cyflwynir samplau rheoli ansawdd o bryd i'w gilydd i'r swp.Dadansoddwyd pob un o'r 11 swp o samplau serwm yn yr astudiaeth hon gan LC-MS.Defnyddiwyd dyfyniadau o gymysgedd pwll serwm gan 100 o roddwyr iach fel deunydd cyfeirio mewn sypiau priodol i fonitro'r broses echdynnu ac addasu ar gyfer effeithiau swp-i-swp.Perfformiwyd dadansoddiad metabolomeg heb ei dargedu o'r garfan ddarganfod, y garfan ddilysu fewnol, a'r garfan ddilysu allanol yng Nghanolfan Metabolomeg Prifysgol Sun Yat-sen.Hefyd dadansoddodd labordy allanol Canolfan Dadansoddi a Phrofi Prifysgol Technoleg Guangdong 40 sampl o'r garfan allanol i brofi perfformiad y model dosbarthwr.
Ar ôl echdynnu ac ailgyfansoddi, mesurwyd meintioli absoliwt metabolion serwm gan ddefnyddio sbectrometreg màs cromatograffaeth hylif perfformiad uchel iawn (pedrupole triphlyg Agilent 6495) gyda ffynhonnell ïoneiddiad electrochwistrellu (ESI) yn y modd monitro adwaith lluosog (MRM).Defnyddiwyd colofn ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Dyfroedd) i wahanu metabolion.Roedd y cyfnod symudol yn cynnwys 90% (A) a 5% acetonitrile (B) gydag asetad amoniwm 10 mmol/L a hydoddiant amonia 0.1%.Roedd y rhaglen graddiant fel a ganlyn: 0–1.5 mun, 0% B;1.5–6.5 mun, 0–15% B;6.5–8 mun, 15% B;8–8.5 mun, 15%–0% B;8.5–11.5 mun, 0%B.Cadwyd y golofn ar 40 ° C a'r sampl ar 10 ° C yn y samplwr awtomatig.Y gyfradd llif oedd 0.3 mL/munud a chyfaint y pigiad oedd 1 μL.Gosodwyd paramedrau MS fel a ganlyn: foltedd capilari ±3.5 kV, pwysedd nebulizer 35 psi, llif nwy gwain 12 L / mun, tymheredd nwy gwain 350 ° C, tymheredd nwy sychu 250 ° C, a sychu llif nwy 14 l / min.Trosiadau MRM tryptoffan, pyrwfad, lactad, hypoxanthine a xanthine oedd 205.0–187.9, 87.0–43.4, 89.0–43.3, 135.0–92.3 a 151.0–107.9 yn y drefn honno.Casglwyd data gan ddefnyddio Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Ar gyfer samplau serwm, mesurwyd tryptoffan, pyruvate, lactad, hypoxanthine, a xanthine gan ddefnyddio cromliniau graddnodi o hydoddiannau cymysgedd safonol.Ar gyfer samplau celloedd, cafodd cynnwys tryptoffan ei normaleiddio i'r safon fewnol a màs protein celloedd.
Perfformiwyd echdynnu brig (m/z ac amser cadw (RT)) gan ddefnyddio Compound Discovery 3.1 a TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Er mwyn dileu gwahaniaethau posibl rhwng sypiau, rhannwyd pob uchafbwynt nodweddiadol o'r sampl prawf â brig nodweddiadol y deunydd cyfeirio o'r un swp i gael y digonedd cymharol.Dangosir gwyriadau safonol cymharol safonau mewnol cyn ac ar ôl safoni yn Nhabl Atodol 6. Nodweddwyd y gwahaniaethau rhwng y ddau grŵp gan gyfradd darganfod ffug (FDR <0.05, prawf rheng wedi'i lofnodi gan Wilcoxon) a newid plyg (> 1.2 neu <0.83).Dangosir data MS crai o'r nodweddion a echdynnwyd a data MS cyfeiriol wedi'i gywiro â serwm yn Data Atodol 1 a Data Atodol 2, yn y drefn honno.Perfformiwyd anodi brig yn seiliedig ar bedair lefel ddiffiniedig o adnabyddiaeth, gan gynnwys metabolion a nodwyd, cyfansoddion â nodiadau tybiedig, dosbarthiadau cyfansawdd â nodweddion tybiedig, a chyfansoddion anhysbys 22 .Yn seiliedig ar chwiliadau cronfa ddata yn Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), cafodd cyfansoddion biolegol ag MS/MS sy'n cyfateb i safonau dilysedig neu anodiadau cyfatebol union yn mzCloud (sgôr > 85) neu Chemspider eu dewis o'r diwedd fel canolradd rhwng y metabolome gwahaniaethol.Mae anodiadau brig ar gyfer pob nodwedd wedi'u cynnwys yn Nata Atodol 3. Defnyddiwyd MetaboAnalyst 5.0 ar gyfer dadansoddiad unnewidyn o helaethrwydd metabolyn wedi'i normaleiddio â swm.Gwerthusodd MetaboAnalyst 5.0 hefyd ddadansoddiad cyfoethogi llwybr KEGG yn seiliedig ar fetabolion sylweddol wahanol.Dadansoddwyd dadansoddiad prif gydran (PCA) a dadansoddiad gwahaniaethol rhannol sgwariau lleiaf (PLS-DA) gan ddefnyddio'r pecyn meddalwedd ropls (v.1.26.4) gyda normaleiddio stac a graddio'n awtomatig.Cynhyrchwyd y model biomarcwr metabolit gorau posibl ar gyfer rhagfynegi malaenedd nodule gan ddefnyddio atchweliad logistaidd deuaidd gyda'r crebachu a'r gweithredwr dethol lleiaf absoliwt (LASSO, pecyn R v.4.1-3).Nodweddwyd perfformiad y model gwahaniaethol yn y setiau canfod a dilysu gan amcangyfrif AUC yn seiliedig ar ddadansoddiad ROC yn ôl y pecyn pROC (v.1.18.0.).Cafwyd y toriad tebygolrwydd optimaidd yn seiliedig ar fynegai Youden uchaf y model (sensitifrwydd + penodolrwydd - 1).Bydd samplau â gwerthoedd sy'n llai neu'n fwy na'r trothwy yn cael eu rhagweld fel nodwlau anfalaen ac adenocarcinoma yr ysgyfaint, yn y drefn honno.
Tyfwyd celloedd A549 (#CCL-185, Casgliad Diwylliant Math Americanaidd) mewn cyfrwng F-12K sy'n cynnwys 10% FBS.RNA hairpin byr (shRNA) dilyniannau targedu SLC7A5 a rheolaeth nontargeting (NC) eu gosod yn y fector lentiviral pLKO.1-puro.Mae dilyniannau antisense shSLC7A5 fel a ganlyn: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′).Prynwyd gwrthgyrff i SLC7A5 (#5347) a thiwbwlin (#2148) gan Cell Signaling Technology.Defnyddiwyd gwrthgyrff i SLC7A5 a thibwlin ar wanhad o 1:1000 ar gyfer dadansoddiad o blotiau'r Gorllewin.
Mae Prawf Straen Glycolytig Seahorse XF yn mesur lefelau asideiddio allgellog (ECAR).Yn yr assay, gweinyddwyd glwcos, oligomycin A, a 2-DG yn olynol i brofi cynhwysedd glycolytig cellog fel y'i mesurwyd gan ECAR.
Cafodd celloedd A549 a drawslifwyd â rheolaeth nad ydynt yn targedu (NC) a shSLC7A5 (Sh1, Sh2) eu platio dros nos mewn dysglau diamedr 10 cm.Echdynnwyd metabolion celloedd gydag 1 ml o fethanol dyfrllyd 80% oerfel iâ.Cafodd celloedd yn yr hydoddiant methanol eu crafu, eu casglu i mewn i diwb newydd, a'u centrifugio ar 15,000 × g am 15 munud ar 4 ° C.Casglwch 800 µl o uwchnatur a'i sychu gan ddefnyddio crynhöwr gwactod cyflym.Yna dadansoddwyd y pelenni metabolit sych ar gyfer lefelau tryptoffan gan ddefnyddio LC-MS/MS fel y disgrifir uchod.Mesurwyd lefelau NAD(H) cellog mewn celloedd A549 (NC a shSLC7A5) gan ddefnyddio pecyn lliwimetrig meintiol NAD +/NADH (#K337, BioVision) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.Mesurwyd lefelau protein ar gyfer pob sampl i normaleiddio maint y metabolion.
Ni ddefnyddiwyd unrhyw ddulliau ystadegol i bennu maint y sampl yn y lle cyntaf.Mae astudiaethau metabolomeg blaenorol wedi'u hanelu at ddarganfod biofarcwr15,18 wedi'u hystyried fel meincnodau ar gyfer pennu maint, ac o gymharu â'r adroddiadau hyn, roedd ein sampl yn ddigonol.Ni chafodd unrhyw samplau eu heithrio o garfan yr astudiaeth.Rhoddwyd samplau serwm ar hap i grŵp darganfod (306 o achosion, 74.6%) a grŵp dilysu mewnol (104 o achosion, 25.4%) ar gyfer astudiaethau metabolomeg heb eu targedu.Fe wnaethom hefyd ddewis 70 o achosion ar hap o bob grŵp o'r set ddarganfod ar gyfer astudiaethau metabolomeg wedi'u targedu.Cafodd yr ymchwilwyr eu dallu i aseiniad grŵp wrth gasglu a dadansoddi data LC-MS.Disgrifir dadansoddiadau ystadegol o ddata metabolomeg ac arbrofion celloedd yn yr adrannau Canlyniadau, Chwedlau Ffigur, a Dulliau priodol.Perfformiwyd meintioli tryptoffan cellog, NADT, a gweithgaredd glycolytig deirgwaith yn annibynnol gyda chanlyniadau union yr un fath.
I gael rhagor o wybodaeth am gynllun yr astudiaeth, gweler yr Adroddiad Portffolio Naturiol Crynodeb sy'n gysylltiedig â'r erthygl hon.
Dangosir data MS amrwd y nodweddion a echdynnwyd a data MS arferol y serwm cyfeirio yn Data Atodol 1 a Data Atodol 2, yn y drefn honno.Cyflwynir anodiadau brig ar gyfer nodweddion gwahaniaethol yn Data Atodol 3. Gellir lawrlwytho set ddata LUAD TCGA o https://portal.gdc.cancer.gov/.Darperir y data mewnbwn ar gyfer plotio'r graff yn y data ffynhonnell.Darperir data ffynhonnell ar gyfer yr erthygl hon.
Grŵp Astudio Sgrinio'r Ysgyfaint Cenedlaethol, ac ati. Lleihau marwolaethau o ganser yr ysgyfaint gyda thomograffeg gyfrifiadurol dos isel.Gogledd Lloegr.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR a Prophet, PC Sgrinio canser yr ysgyfaint gan ddefnyddio CT helical dos isel: canlyniadau o Astudiaeth Sgrinio Genedlaethol yr Ysgyfaint (NLST).J. Med.Sgrin 18, 109–111 (2011).
Mae De Koning, HJ, et al.Lleihau marwolaethau o ganser yr ysgyfaint gyda sgrinio CT cyfeintiol mewn treial ar hap.Gogledd Lloegr.J. Med.382, 503–513 (2020).
Amser post: Medi-18-2023