Mae diagnosis gwahaniaethol o nodau ysgyfeiniol a nodwyd gan domograffeg gyfrifiadurol (CT) yn parhau i fod yn her mewn ymarfer clinigol. Yma, rydym yn nodweddu metabolom byd-eang 480 o samplau serwm, gan gynnwys rheolyddion iach, nodau ysgyfeiniol diniwed, ac adenocarsinoma ysgyfeiniol cam I. Mae adenocarsinomas yn arddangos proffiliau metabolomig unigryw, tra bod gan nodau diniwed ac unigolion iach debygrwydd uchel o ran proffiliau metabolomig. Yn y grŵp darganfod (n = 306), nodwyd set o 27 o fetabolion i wahaniaethu rhwng nodau diniwed a malaen. Roedd AUC y model gwahaniaethol yn y grwpiau dilysu mewnol (n = 104) a dilysu allanol (n = 111) yn 0.915 a 0.945, yn y drefn honno. Datgelodd dadansoddiad llwybr fetabolion glycolytig cynyddol sy'n gysylltiedig â tryptophan is mewn serwm adenocarsinoma ysgyfeiniol o'i gymharu â nodau diniwed a rheolyddion iach, ac awgrymodd fod cymeriant tryptophan yn hyrwyddo glycolysis mewn celloedd canser yr ysgyfaint. Mae ein hastudiaeth yn tynnu sylw at werth biomarcwyr metabolyn serwm wrth asesu'r risg o nodiwlau ysgyfeiniol a ganfyddir gan sgan CT.
Mae diagnosis cynnar yn hanfodol i wella cyfraddau goroesi cleifion canser. Mae canlyniadau o Dreial Sgrinio Canser yr Ysgyfaint Cenedlaethol yr Unol Daleithiau (NLST) ac Astudiaeth NELSON Ewropeaidd wedi dangos y gall sgrinio gyda thomograffeg gyfrifiadurol dos isel (LDCT) leihau marwolaethau canser yr ysgyfaint yn sylweddol mewn grwpiau risg uchel1,2,3. Ers defnyddio LDCT yn eang ar gyfer sgrinio canser yr ysgyfaint, mae nifer yr achosion o ganfyddiadau radiograffig damweiniol o nodau ysgyfeiniol asymptomatig wedi parhau i gynyddu4. Diffinnir nodau ysgyfeiniol fel anhryloywder ffocal hyd at 3 cm mewn diamedr5. Rydym yn wynebu anawsterau wrth asesu tebygolrwydd malaenedd ac ymdrin â'r nifer fawr o nodau ysgyfeiniol a ganfyddir yn ddamweiniol ar LDCT. Gall cyfyngiadau CT arwain at archwiliadau dilynol mynych a chanlyniadau positif ffug, gan arwain at ymyrraeth a gor-driniaeth ddiangen6. Felly, mae angen datblygu biomarcwyr dibynadwy a defnyddiol i adnabod canser yr ysgyfaint yn gywir yn y camau cynnar a gwahaniaethu rhwng y rhan fwyaf o nodau diniwed ar y canfod cychwynnol7.
Mae dadansoddiad moleciwlaidd cynhwysfawr o waed (serwm, plasma, celloedd mononiwclear gwaed ymylol), gan gynnwys genomig, proteomeg neu fethyleiddio DNA8,9,10, wedi arwain at ddiddordeb cynyddol mewn darganfod biomarcwyr diagnostig ar gyfer canser yr ysgyfaint. Yn y cyfamser, mae dulliau metabolomeg yn mesur cynhyrchion terfynol cellog sy'n cael eu dylanwadu gan weithredoedd mewndarddol ac alldarddol ac felly'n cael eu defnyddio i ragweld dechrau a chanlyniad clefydau. Mae cromatograffaeth hylif-sbectrometreg màs tandem (LC-MS) yn ddull a ddefnyddir yn helaeth ar gyfer astudiaethau metabolomeg oherwydd ei sensitifrwydd uchel a'i ystod ddeinamig fawr, a all gwmpasu metabolion â gwahanol briodweddau ffisegemegol11,12,13. Er bod dadansoddiad metabolomeg byd-eang o plasma/serwm wedi'i ddefnyddio i nodi biomarcwyr sy'n gysylltiedig â diagnosis o ganser yr ysgyfaint14,15,16,17 ac effeithiolrwydd triniaeth,18 mae dosbarthwyr metabolyn serwm i wahaniaethu rhwng nodau ysgyfaint diniwed a malaen yn parhau i fod heb eu hastudio llawer. -ymchwil enfawr.
Adenocarsinoma a charsinoma celloedd cennog yw'r ddau brif isdeip o ganser yr ysgyfaint nad yw'n gell fach (NSCLC). Mae amrywiol brofion sgrinio CT yn dangos mai adenocarsinoma yw'r math histolegol mwyaf cyffredin o ganser yr ysgyfaint1,19,20,21. Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom ddefnyddio cromatograffaeth hylif perfformiad uwch-sbectrometreg màs cydraniad uchel (UPLC-HRMS) i gynnal dadansoddiad metabolomeg ar gyfanswm o 695 o samplau serwm, gan gynnwys rheolyddion iach, nodau anfalaen yr ysgyfaint, a ≤3 cm a ganfuwyd gan CT. Sgrinio ar gyfer adenocarsinoma ysgyfaint Cyfnod I. Fe wnaethom nodi panel o fetabolion serwm sy'n gwahaniaethu adenocarsinoma'r ysgyfaint oddi wrth nodau anfalaen a rheolyddion iach. Datgelodd dadansoddiad cyfoethogi llwybr fod metaboledd tryptophan a glwcos annormal yn newidiadau cyffredin mewn adenocarsinoma'r ysgyfaint o'i gymharu â nodau anfalaen a rheolyddion iach. Yn olaf, fe wnaethom sefydlu a dilysu dosbarthwr metabolaidd serwm gyda manylder a sensitifrwydd uchel i wahaniaethu rhwng nodau ysgyfeiniol malaen ac anfalaen a ganfuwyd gan LDCT, a all gynorthwyo gyda diagnosis gwahaniaethol cynnar ac asesiad risg.
Yn yr astudiaeth gyfredol, casglwyd samplau serwm cyfatebol o ran rhyw ac oedran yn ôl-weithredol gan 174 o reolyddion iach, 292 o gleifion â nodwlau ysgyfeiniol anfalaen, a 229 o gleifion ag adenocarsinoma ysgyfeiniol cam I. Dangosir nodweddion demograffig y 695 o bynciau yn Nhabl Atodol 1.
Fel y dangosir yn Ffigur 1a, casglwyd cyfanswm o 480 o samplau serwm, gan gynnwys 174 o reolwyr iach (HC), 170 o nodau anfalaen (BN), a 136 o samplau adenocarsinoma ysgyfaint (LA) cam I, yng Nghanolfan Canser Prifysgol Sun Yat-sen. Cohort darganfod ar gyfer proffilio metabolig heb ei dargedu gan ddefnyddio cromatograffaeth hylif perfformiad uwch-sbectrometreg màs cydraniad uchel (UPLC-HRMS). Fel y dangosir yn Ffigur Atodol 1, nodwyd metabolion gwahaniaethol rhwng LA a HC, LA a BN i sefydlu model dosbarthu ac archwilio dadansoddiad llwybr gwahaniaethol ymhellach. Cafodd 104 o samplau a gasglwyd gan Ganolfan Canser Prifysgol Sun Yat-sen a 111 o samplau a gasglwyd gan ddau ysbyty arall eu dilysu'n fewnol ac yn allanol, yn y drefn honno.
a Poblogaeth astudio yn y garfan darganfod a gafodd ddadansoddiad metabolomeg serwm byd-eang gan ddefnyddio cromatograffaeth hylif perfformiad uwch-sbectrometreg màs cydraniad uchel (UPLC-HRMS). b Dadansoddiad gwahaniaethol sgwariau lleiaf rhannol (PLS-DA) o gyfanswm metabolom 480 o samplau serwm o'r garfan astudio, gan gynnwys rheolyddion iach (HC, n = 174), nodau diniwlau (BN, n = 170), ac adenocarsinoma ysgyfaint cam I (Los Angeles, n = 136). +ESI, modd ïoneiddio electrochwistrellu positif, -ESI, modd ïoneiddio electrochwistrellu negatif. c–e Dangosir metabolitau â helaethrwydd sylweddol wahanol mewn dau grŵp penodol (prawf rheng wedi'i lofnodi Wilcoxon dau gynffon, gwerth p wedi'i addasu ar gyfer cyfradd darganfod ffug, FDR <0.05) mewn coch (newid plyg > 1.2) a glas (newid plyg < 0.83). ) a ddangosir ar y graffig llosgfynydd. f Map gwres clwstwr hierarchaidd yn dangos gwahaniaethau sylweddol yn nifer y metabolitau wedi'u hanodio rhwng LA a BN. Darperir data ffynhonnell ar ffurf ffeiliau data ffynhonnell.
Dadansoddwyd cyfanswm metabolom serwm 174 HC, 170 BN a 136 LA yn y grŵp darganfod gan ddefnyddio dadansoddiad UPLC-HRMS. Yn gyntaf, rydym yn dangos bod samplau rheoli ansawdd (QC) yn clystyru'n dynn yng nghanol model dadansoddi prif gydrannau (PCA) heb oruchwyliaeth, gan gadarnhau sefydlogrwydd perfformiad yr astudiaeth gyfredol (Ffigur Atodol 2).
Fel y dangosir yn y dadansoddiad gwahaniaethol sgwariau lleiaf rhannol (PLS-DA) yn Ffigur 1b, gwelsom fod gwahaniaethau clir rhwng LA a BN, LA a HC mewn moddau ïoneiddio electrochwistrellu positif (+ESI) a negatif (−ESI). Fodd bynnag, ni chanfuwyd unrhyw wahaniaethau arwyddocaol rhwng BN a HC mewn amodau +ESI ac -ESI.
Fe wnaethon ni ganfod 382 o nodweddion gwahaniaethol rhwng LA a HC, 231 o nodweddion gwahaniaethol rhwng LA a BN, a 95 o nodweddion gwahaniaethol rhwng BN a HC (prawf rheng wedi'i lofnodi Wilcoxon, FDR <0.05 a newid lluosog >1.2 neu <0.83) (Ffigur .1c-e). . Cafodd copaon eu hanodio ymhellach (Data Atodol 3) yn erbyn cronfa ddata (llyfrgell mzCloud/HMDB/Chemspider) yn ôl gwerth m/z, amser cadw a chwiliad sbectrwm màs darnio (manylion a ddisgrifir yn yr adran Dulliau) 22 . Yn olaf, nodwyd 33 a 38 o fetabolion wedi'u hanodio gyda gwahaniaethau sylweddol mewn helaethrwydd ar gyfer LA yn erbyn BN (Ffigur 1f a Thabl Atodol 2) ac LA yn erbyn HC (Ffigur Atodol 3 a Thabl Atodol 2), yn y drefn honno. Mewn cyferbyniad, dim ond 3 metabolyn gyda gwahaniaethau sylweddol mewn helaethrwydd a nodwyd yn BN a HC (Tabl Atodol 2), yn gyson â'r gorgyffwrdd rhwng BN a HC yn PLS-DA. Mae'r metabolion gwahaniaethol hyn yn cwmpasu ystod eang o fiogemegolion (Ffigur Atodol 4). Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn dangos newidiadau sylweddol yn y metabolom serwm sy'n adlewyrchu trawsnewidiad malaen canser yr ysgyfaint cam cynnar o'i gymharu â nodau ysgyfaint diniwed neu bobl iach. Yn y cyfamser, mae tebygrwydd metabolom serwm BN a HC yn awgrymu y gall nodau ysgyfeiniol diniwed rannu llawer o nodweddion biolegol ag unigolion iach. O ystyried bod mwtaniadau genynnau derbynnydd ffactor twf epidermaidd (EGFR) yn gyffredin yn isdeip 23 adenocarsinoma ysgyfaint, fe geisiom bennu effaith mwtaniadau gyrrwr ar y metabolom serwm. Yna dadansoddom broffil metabolomig cyffredinol 72 o achosion â statws EGFR yn y grŵp adenocarsinoma ysgyfaint. Yn ddiddorol, gwelsom broffiliau cymharol rhwng cleifion â mwtant EGFR (n = 41) a chleifion math gwyllt EGFR (n = 31) mewn dadansoddiad PCA (Ffigur Atodol 5a). Fodd bynnag, fe wnaethom nodi 7 metabolyn y newidiwyd eu helaethrwydd yn sylweddol mewn cleifion â mwtaniad EGFR o'i gymharu â chleifion ag EGFR math gwyllt (prawf t, p < 0.05 a newid plyg > 1.2 neu < 0.83) (Ffigur Atodol 5b). Mae mwyafrif y metabolynau hyn (5 allan o 7) yn asylcarnitinau, sy'n chwarae rhan bwysig mewn llwybrau ocsideiddio asid brasterog.
Fel y dangosir yn y llif gwaith a ddangosir yn Ffigur 2a, cafwyd biomarcwyr ar gyfer dosbarthu nodau gan ddefnyddio gweithredwyr crebachu absoliwt lleiaf a dewis yn seiliedig ar 33 o fetabolion gwahaniaethol a nodwyd yn LA (n = 136) a BN (n = 170). Cyfuniad gorau o newidynnau (LASSO) – model atchweliad logistaidd deuaidd. Defnyddiwyd croes-ddilysu deg gwaith i brofi dibynadwyedd y model. Addasir dewis newidynnau a rheoleiddio paramedrau gan gosb uchafswm tebygolrwydd gyda pharamedr λ24. Perfformiwyd dadansoddiad metabolomeg byd-eang ymhellach yn annibynnol yn y grwpiau dilysu mewnol (n = 104) a dilysu allanol (n = 111) i brofi perfformiad dosbarthu'r model gwahaniaethol. O ganlyniad, nodwyd 27 o fetabolion yn y set ddarganfod fel y model gwahaniaethol gorau gyda'r gwerth AUC cymedrig mwyaf (Ffig. 2b), ac ymhlith y rhain roedd gan 9 weithgaredd cynyddol a 18 weithgaredd is yn LA o'i gymharu â BN (Ffig. 2c).
Llif gwaith ar gyfer adeiladu dosbarthwr nodau ysgyfeiniol, gan gynnwys dewis y panel gorau o fetabolion serwm yn y set ddarganfod gan ddefnyddio model atchweliad logistaidd deuaidd trwy groes-ddilysu deg gwaith a gwerthuso perfformiad rhagfynegol mewn setiau dilysu mewnol ac allanol. b Ystadegau croes-ddilysu model atchweliad LASSO ar gyfer dewis biomarcwyr metabolaidd. Mae'r niferoedd a roddir uchod yn cynrychioli nifer cyfartalog y biomarcwyr a ddewiswyd ar λ penodol. Mae'r llinell ddotiog goch yn cynrychioli'r gwerth AUC cyfartalog ar y lambda cyfatebol. Mae bariau gwall llwyd yn cynrychioli'r gwerthoedd AUC lleiaf ac uchaf. Mae'r llinell ddotiog yn nodi'r model gorau gyda'r 27 biomarcwr a ddewiswyd. AUC, arwynebedd o dan gromlin nodwedd weithredu derbynnydd (ROC). c Newidiadau plyg 27 metabolyn a ddewiswyd yn y grŵp LA o'i gymharu â'r grŵp BN yn y grŵp darganfod. Colofn goch - actifadu. Mae'r golofn las yn ddirywiad. d–f Cromliniau nodwedd gweithredu derbynnydd (ROC) sy'n dangos pŵer y model gwahaniaethol yn seiliedig ar 27 cyfuniad metabolyn yn y setiau dilysu darganfod, mewnol ac allanol. Darperir data ffynhonnell ar ffurf ffeiliau data ffynhonnell.
Crëwyd model rhagfynegi yn seiliedig ar gyfernodau atchweliad pwysol y 27 metabolyn hyn (Tabl Atodol 3). Cynhyrchodd dadansoddiad ROC yn seiliedig ar y 27 metabolyn hyn werth arwynebedd o dan y gromlin (AUC) o 0.933, sensitifrwydd grŵp darganfod oedd 0.868, a manylder oedd 0.859 (Ffig. 2d). Yn y cyfamser, ymhlith y 38 metabolyn gwahaniaethol a anodiwyd rhwng LA a HC, cyflawnodd set o 16 metabolyn AUC o 0.902 gyda sensitifrwydd o 0.801 a manylder o 0.856 wrth wahaniaethu rhwng LA a HC (Ffigur Atodol 6a-c). Cymharwyd gwerthoedd AUC yn seiliedig ar drothwyon newid plyg gwahanol ar gyfer metabolynau gwahaniaethol hefyd. Gwelsom fod y model dosbarthu yn perfformio orau wrth wahaniaethu rhwng LA a BN (HC) pan osodwyd y lefel newid plyg i 1.2 yn erbyn 1.5 neu 2.0 (Ffigur Atodol 7a,b). Cafodd y model dosbarthu, yn seiliedig ar 27 grŵp metabolyn, ei ddilysu ymhellach mewn cohortau mewnol ac allanol. Roedd yr AUC yn 0.915 (sensitifrwydd 0.867, penodolrwydd 0.811) ar gyfer dilysu mewnol a 0.945 (sensitifrwydd 0.810, penodolrwydd 0.979) ar gyfer dilysu allanol (Ffig. 2e, f). Er mwyn asesu effeithlonrwydd rhynglabordy, dadansoddwyd 40 sampl o'r cohort allanol mewn labordy allanol fel y disgrifir yn yr adran Dulliau. Cyflawnodd cywirdeb y dosbarthiad AUC o 0.925 (Ffigur Atodol 8). Gan mai carsinoma celloedd cennog yr ysgyfaint (LUSC) yw'r ail isdeip mwyaf cyffredin o ganser yr ysgyfaint nad yw'n gelloedd bach (NSCLC) ar ôl adenocarsinoma'r ysgyfaint (LUAD), fe wnaethom hefyd brofi potensial dilys proffiliau metabolaidd. BN a 16 achos o LUSC. Roedd AUC gwahaniaethu rhwng LUSC a BN yn 0.776 (Ffigur Atodol 9), sy'n dynodi gallu gwaeth o'i gymharu â gwahaniaethu rhwng LUAD a BN.
Mae astudiaethau wedi dangos bod maint nodau ar ddelweddau CT yn gysylltiedig yn gadarnhaol â thebygolrwydd malaenedd ac yn parhau i fod yn ffactor pwysig sy'n pennu triniaeth nodau25,26,27. Dangosodd dadansoddiad o ddata o'r garfan fawr o astudiaeth sgrinio NELSON fod y risg o falaenedd mewn pynciau â nodau <5 mm hyd yn oed yn debyg i'r risg mewn pynciau heb nodau28. Felly, y maint lleiaf sy'n gofyn am fonitro CT yn rheolaidd yw 5 mm, fel yr argymhellir gan Gymdeithas Thorasig Prydain (BTS), a 6 mm, fel yr argymhellir gan Gymdeithas Fleischner29. Fodd bynnag, mae nodau sy'n fwy na 6 mm a heb nodweddion diniwed amlwg, a elwir yn nodau ysgyfeiniol amhenodol (IPN), yn parhau i fod yn her fawr wrth werthuso a rheoli mewn ymarfer clinigol30,31. Nesaf, archwiliwyd a oedd maint y nodau yn dylanwadu ar lofnodion metabolig gan ddefnyddio samplau cronedig o'r carfannau darganfod a dilysu mewnol. Gan ganolbwyntio ar 27 o fiomarcwyr dilys, cymharwyd proffiliau PCA metabolomau HC a BN is-6 mm yn gyntaf. Gwelsom fod y rhan fwyaf o'r pwyntiau data ar gyfer HC a BN yn gorgyffwrdd, gan ddangos bod lefelau metabolyn serwm yn debyg yn y ddau grŵp (Ffig. 3a). Arhosodd y mapiau nodwedd ar draws gwahanol ystodau maint wedi'u cadw yn BN ac LA (Ffig. 3b, c), tra gwelwyd gwahaniad rhwng nodau malaen ac anfalaen yn yr ystod 6–20 mm (Ffig. 3d). Roedd gan y garfan hon AUC o 0.927, penodolrwydd o 0.868, a sensitifrwydd o 0.820 ar gyfer rhagweld malaenedd nodau sy'n mesur 6 i 20 mm (Ffig. 3e, f). Mae ein canlyniadau'n dangos y gall y dosbarthwr ddal newidiadau metabolaidd a achosir gan drawsnewidiad malaen cynnar, waeth beth fo maint y nodau.
Cymhariaeth o broffiliau PCA rhwng grwpiau penodedig yn seiliedig ar ddosbarthwr metabolig o 27 metabolyn. CC a BN < 6 mm. b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm. mewn LA 6–20 mm yn erbyn LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm ac LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Cromlin nodwedd gweithredu derbynnydd (ROC) yn dangos perfformiad model gwahaniaethol ar gyfer nodau 6–20 mm. f Cyfrifwyd gwerthoedd tebygolrwydd yn seiliedig ar y model atchweliad logistaidd ar gyfer nodau sy'n mesur 6–20 mm. Mae'r llinell ddotiog lwyd yn cynrychioli'r gwerth torbwynt gorau posibl (0.455). Mae'r niferoedd uchod yn cynrychioli canran yr achosion a ragwelir ar gyfer Los Angeles. Defnyddiwch brawf-t Myfyriwr dwy-gynffon. PCA, dadansoddiad cydrannau pennaf. Arwynebedd AUC o dan y gromlin. Darperir data ffynhonnell ar ffurf ffeiliau data ffynhonnell.
Dewiswyd pedwar sampl (44–61 oed) gyda meintiau nodau ysgyfeiniol tebyg (7–9 mm) ymhellach i ddangos perfformiad y model rhagfynegi malaenedd arfaethedig (Ffig. 4a, b). Ar y sgrinio cychwynnol, cyflwynodd Achos 1 fel nodwl solet gyda chalcheiddiad, nodwedd sy'n gysylltiedig â diniwed, tra bod Achos 2 yn cyflwyno fel nodwl rhannol solet amhenodol heb unrhyw nodweddion diniwed amlwg. Dangosodd tair rownd o sganiau CT dilynol fod yr achosion hyn wedi aros yn sefydlog dros gyfnod o 4 blynedd ac felly fe'u hystyriwyd yn nodau diniwed (Ffig. 4a). O'i gymharu â gwerthusiad clinigol o sganiau CT cyfresol, nododd dadansoddiad metabolyn serwm un ergyd gyda'r model dosbarthwr cyfredol y nodau diniwed hyn yn gyflym ac yn gywir yn seiliedig ar gyfyngiadau tebygolrwydd (Tabl 1). Mae Ffigur 4b yn achos 3 yn dangos nodwl gydag arwyddion o dynnu'n ôl plewrol, sydd fel arfer yn gysylltiedig â malaenedd32. Cyflwynodd Achos 4 fel nodwl rhannol solet amhenodol heb unrhyw dystiolaeth o achos diniwed. Rhagfynegwyd yr holl achosion hyn fel rhai malaen yn ôl y model dosbarthwr (Tabl 1). Dangoswyd yr asesiad o adenocarsinoma ysgyfaint trwy archwiliad histopatholegol ar ôl llawdriniaeth tynnu'r ysgyfaint (Ffig. 4b). Ar gyfer y set ddilysu allanol, rhagfynegodd y dosbarthwr metabolig ddau achos o nodau ysgyfaint amhenodol yn fwy na 6 mm yn gywir (Ffigur Atodol 10).
Delweddau CT o ffenestr echelinol yr ysgyfaint mewn dau achos o nodau diniwed. Yn achos 1, dangosodd sgan CT ar ôl 4 blynedd nodwl solet sefydlog yn mesur 7 mm gyda chalcheiddiad yn y llabed dde isaf. Yn achos 2, datgelodd sgan CT ar ôl 5 mlynedd nodwl sefydlog, rhannol solet gyda diamedr o 7 mm yn y llabed dde uchaf. b Delweddau CT ffenestr echelinol o'r ysgyfaint ac astudiaethau patholegol cyfatebol o ddau achos o adenocarsinoma cam I cyn echdoriad yr ysgyfaint. Datgelodd achos 3 nodwl gyda diamedr o 8 mm yn y llabed dde uchaf gyda thynnu'n ôl plewrol. Datgelodd achos 4 nodwl gwydr daear rhannol solet yn mesur 9 mm yn y llabed chwith uchaf. Staenio hematoxylin ac eosin (H&E) o feinwe'r ysgyfaint wedi'i echdorri (bar graddfa = 50 μm) yn dangos patrwm twf acinar adenocarsinoma'r ysgyfaint. Mae'r saethau'n dynodi nodau a ganfuwyd ar ddelweddau CT. Mae delweddau H&E yn ddelweddau cynrychioliadol o feysydd microsgopig lluosog (>3) a archwiliwyd gan y patholegydd.
Gyda'i gilydd, mae ein canlyniadau'n dangos gwerth posibl biomarcwyr metabolyn serwm wrth wneud diagnosis gwahaniaethol o nodau ysgyfeiniol, a all beri heriau wrth werthuso sgrinio CT.
Yn seiliedig ar banel metabolyn gwahaniaethol dilys, fe geisiom nodi cydberthnasau biolegol newidiadau metabolaidd mawr. Nododd dadansoddiad cyfoethogi llwybr KEGG gan MetaboAnalyst 6 llwybr cyffredin wedi'u newid yn sylweddol rhwng y ddau grŵp penodol (LA vs. HC ac LA vs. BN, p wedi'i addasu ≤ 0.001, effaith > 0.01). Nodweddwyd y newidiadau hyn gan aflonyddwch mewn metaboledd pyruvat, metaboledd tryptoffan, metaboledd niacin a nicotinamid, glycolysis, y cylch TCA, a metaboledd piwrin (Ffig. 5a). Yna fe wnaethom gynnal metabolomeg wedi'i thargedu ymhellach i wirio newidiadau mawr gan ddefnyddio meintioli absoliwt. Penderfynu ar fetabolion cyffredin mewn llwybrau wedi'u newid yn gyffredin trwy sbectrometreg màs triphlyg cwadrupol (QQQ) gan ddefnyddio safonau metabolyn dilys. Mae nodweddion demograffig sampl targed yr astudiaeth metabolomeg wedi'u cynnwys yn Nhabl Atodol 4. Yn gyson â'n canlyniadau metabolomeg byd-eang, cadarnhaodd dadansoddiad meintiol fod hypocsantin a xantin, pyruvat, a lactad wedi cynyddu yn LA o'i gymharu â BN a HC (Ffig. 5b, c, p <0.05). Fodd bynnag, ni chanfuwyd unrhyw wahaniaethau arwyddocaol yn y metabolion hyn rhwng BN a HC.
Dadansoddiad cyfoethogi llwybr KEGG o fetabolion gwahanol iawn yn y grŵp LA o'i gymharu â'r grwpiau BN a HC. Defnyddiwyd Prawf Byd-eang dwy-gynffon, ac addaswyd gwerthoedd p gan ddefnyddio'r dull Holm-Bonferroni (p wedi'i addasu ≤ 0.001 a maint yr effaith > 0.01). b–d Plotiau ffidil yn dangos lefelau hypocsantin, xantin, lactad, pyruvat, a tryptoffan mewn serwm HC, BN, ac LA a bennwyd gan LC-MS/MS (n = 70 fesul grŵp). Mae llinellau dotiog gwyn a du yn nodi'r canolrif a'r chwartel, yn y drefn honno. e Plot ffidil yn dangos mynegiant mRNA Log2TPM (trawsgrifiadau fesul miliwn) wedi'i normaleiddio o SLC7A5 a QPRT mewn adenocarsinoma ysgyfaint (n = 513) o'i gymharu â meinwe ysgyfaint arferol (n = 59) yn y set ddata LUAD-TCGA. Mae'r blwch gwyn yn cynrychioli'r amrediad rhyngchwartel, mae'r llinell ddu lorweddol yn y canol yn cynrychioli'r canolrif, ac mae'r llinell ddu fertigol sy'n ymestyn o'r blwch yn cynrychioli'r cyfwng hyder 95% (CI). f Plot cydberthynas Pearson o fynegiant SLC7A5 a GAPDH mewn adenocarsinoma ysgyfaint (n = 513) a meinwe ysgyfaint arferol (n = 59) yn y set ddata TCGA. Mae'r ardal lwyd yn cynrychioli'r CI 95%. r, cyfernod cydberthynas Pearson. g Lefelau tryptoffan cellog wedi'u normaleiddio mewn celloedd A549 wedi'u trawsffectio â rheolaeth shRNA anbenodol (NC) a shSLC7A5 (Sh1, Sh2) wedi'u pennu gan LC-MS/MS. Cyflwynir dadansoddiad ystadegol o bum sampl annibynnol yn fiolegol ym mhob grŵp. h Lefelau cellog NADt (cyfanswm NAD, gan gynnwys NAD+ a NADH) mewn celloedd A549 (NC) a chelloedd A549 wedi'u cnocio i lawr SLC7A5 (Sh1, Sh2). Cyflwynir dadansoddiad ystadegol o dair sampl annibynnol yn fiolegol ym mhob grŵp. i Mesurwyd gweithgaredd glycolytig celloedd A549 cyn ac ar ôl cwympo SLC7A5 gan gyfradd asideiddio allgellog (ECAR) (n = 4 sampl annibynnol yn fiolegol fesul grŵp). 2-DG,2-deoxy-D-glwcos. Defnyddiwyd prawf-t Myfyriwr dau gynffon yn (b–h). Yn (g–i), mae bariau gwall yn cynrychioli'r cymedr ± SD, perfformiwyd pob arbrawf dair gwaith yn annibynnol ac roedd y canlyniadau'n debyg. Darperir data ffynhonnell ar ffurf ffeiliau data ffynhonnell.
O ystyried effaith sylweddol metaboledd tryptophan wedi'i newid yn y grŵp LA, fe wnaethom hefyd asesu lefelau tryptophan serwm yn y grwpiau HC, BN, ac LA gan ddefnyddio QQQ. Gwelsom fod tryptophan serwm wedi'i leihau yn LA o'i gymharu â HC neu BN (p < 0.001, Ffigur 5d), sy'n gyson â chanfyddiadau blaenorol bod lefelau tryptophan sy'n cylchredeg yn is mewn cleifion â chanser yr ysgyfaint nag mewn rheolyddion iach o'r grŵp rheoli33,34,35. Canfu astudiaeth arall gan ddefnyddio olrheinydd PET/CT 11C-methyl-L-tryptophan fod yr amser cadw signal tryptophan mewn meinwe canser yr ysgyfaint wedi cynyddu'n sylweddol o'i gymharu â briwiau anfalaen neu feinwe arferol36. Rydym yn rhagdybio y gallai'r gostyngiad mewn tryptophan mewn serwm LA adlewyrchu cymeriant tryptophan gweithredol gan gelloedd canser yr ysgyfaint.
Mae hefyd yn hysbys mai cynnyrch terfynol llwybr kynurenine catabolism tryptophan yw NAD+37,38, sy'n swbstrad pwysig ar gyfer adwaith glyseraldehyde-3-ffosffad ag 1,3-bisffosffoglyserad mewn glycolysis39. Er bod astudiaethau blaenorol wedi canolbwyntio ar rôl catabolism tryptophan mewn rheoleiddio imiwnedd, fe geisiom egluro'r rhyngweithio rhwng camreoleiddio tryptophan a llwybrau glycolytig a welwyd yn yr astudiaeth gyfredol. Mae'n hysbys bod teulu cludwyr hydoddyn 7 aelod 5 (SLC7A5) yn gludwr tryptophan43,44,45. Mae ffosfforibosyltransferase asid cwinoliniaidd (QPRT) yn ensym sydd wedi'i leoli i lawr yr afon o'r llwybr kynurenine sy'n trosi asid cwinoliniaidd i NAMN46. Datgelodd archwiliad o set ddata LUAD TCGA fod SLC7A5 a QPRT wedi'u huchreoleiddio'n sylweddol mewn meinwe tiwmor o'i gymharu â meinwe arferol (Ffig. 5e). Gwelwyd y cynnydd hwn yng nghyfnodau I a II yn ogystal â chyfnodau III a IV o adenocarsinoma'r ysgyfaint (Ffigur Atodol 11), sy'n dynodi aflonyddwch cynnar ym metaboledd tryptoffan sy'n gysylltiedig â thiwmorigenesis.
Yn ogystal, dangosodd y set ddata LUAD-TCGA gydberthynas gadarnhaol rhwng mynegiant mRNA SLC7A5 a GAPDH mewn samplau cleifion canser (r = 0.45, p = 1.55E-26, Ffigur 5f). Mewn cyferbyniad, ni chanfuwyd unrhyw gydberthynas arwyddocaol rhwng llofnodion genynnau o'r fath mewn meinwe ysgyfaint arferol (r = 0.25, p = 0.06, Ffigur 5f). Gostyngodd dileu SLC7A5 (Ffigur Atodol 12) mewn celloedd A549 lefelau tryptophan cellog a NAD(H) yn sylweddol (Ffigur 5g,h), gan arwain at weithgaredd glycolytig gwanedig fel y'i mesurwyd gan gyfradd asideiddio allgellog (ECAR) (Ffigur 1). 5i). Felly, yn seiliedig ar newidiadau metabolaidd mewn serwm a chanfod in vitro, rydym yn rhagdybio y gall metaboledd tryptophan gynhyrchu NAD+ trwy'r llwybr kynurenine a chwarae rhan bwysig wrth hyrwyddo glycolysis mewn canser yr ysgyfaint.
Mae astudiaethau wedi dangos y gall nifer fawr o nodau ysgyfeiniol amhenodol a ganfyddir gan sgan LDCT arwain at yr angen am brofion ychwanegol fel PET-CT, biopsi ysgyfeiniol, a gor-driniaeth oherwydd diagnosis positif ffug o falaenedd.31 Fel y dangosir yn Ffigur 6, nododd ein hastudiaeth banel o fetabolion serwm â gwerth diagnostig posibl a allai wella haenu risg a rheolaeth ddilynol o nodau ysgyfeiniol a ganfyddir gan sgan CT.
Caiff nodau ysgyfeiniol eu gwerthuso gan ddefnyddio tomograffeg gyfrifiadurol dos isel (LDCT) gyda nodweddion delweddu sy'n awgrymu achosion diniwed neu falaen. Gall canlyniad ansicr nodau arwain at ymweliadau dilynol mynych, ymyriadau diangen, a gor-driniaeth. Gall cynnwys dosbarthwyr metabolaidd serwm sydd â gwerth diagnostig wella asesiad risg a rheolaeth ddilynol nodau ysgyfeiniol. Tomograffeg allyriadau positron PET.
Mae data o astudiaeth NLST yr Unol Daleithiau ac astudiaeth NELSON Ewrop yn awgrymu y gallai sgrinio grwpiau risg uchel gyda thomograffeg gyfrifiadurol dos isel (LDCT) leihau marwolaethau o ganser yr ysgyfaint1,3. Fodd bynnag, asesu risg a rheolaeth glinigol ddilynol o nifer fawr o nodau ysgyfeiniol damweiniol a ganfyddir gan LDCT yw'r mwyaf heriol o hyd. Y prif nod yw optimeiddio dosbarthiad cywir protocolau presennol sy'n seiliedig ar LDCT trwy ymgorffori biomarcwyr dibynadwy.
Mae rhai biomarcwyr moleciwlaidd, fel metabolion gwaed, wedi'u nodi trwy gymharu canser yr ysgyfaint â rheolyddion iach15,17. Yn yr astudiaeth gyfredol, fe wnaethom ganolbwyntio ar gymhwyso dadansoddiad metabolomeg serwm i wahaniaethu rhwng nodau ysgyfeiniol diniwed a malaen a ganfuwyd yn ddamweiniol gan LDCT. Fe wnaethom gymharu metabolom serwm byd-eang samplau rheolydd iach (HC), nodau ysgyfeiniol diniwed (BN), ac adenocarsinoma ysgyfeiniol (LA) cam I gan ddefnyddio dadansoddiad UPLC-HRMS. Fe wnaethom ganfod bod gan HC a BN broffiliau metabolaidd tebyg, tra bod LA yn dangos newidiadau sylweddol o'i gymharu â HC a BN. Fe wnaethom nodi dau set o fetabolion serwm sy'n gwahaniaethu LA oddi wrth HC a BN.
Mae'r cynllun adnabod cyfredol sy'n seiliedig ar LDCT ar gyfer nodau diniwed a malaen yn seiliedig yn bennaf ar faint, dwysedd, morffoleg a chyfradd twf nodau dros amser30. Mae astudiaethau blaenorol wedi dangos bod maint nodau yn gysylltiedig yn agos â'r tebygolrwydd o ganser yr ysgyfaint. Hyd yn oed mewn cleifion risg uchel, mae'r risg o falaenedd mewn nodau <6 mm yn <1%. Mae'r risg o falaenedd ar gyfer nodau sy'n mesur 6 i 20 mm yn amrywio o 8% i 64%30. Felly, mae Cymdeithas Fleischner yn argymell diamedr torri o 6 mm ar gyfer dilyniant CT arferol.29 Fodd bynnag, nid yw asesu risg a rheoli nodau ysgyfeiniol amhenodol (IPN) sy'n fwy na 6 mm wedi'u perfformio'n ddigonol31. Mae rheoli clefyd y galon cynhenid ar hyn o bryd fel arfer yn seiliedig ar aros yn wyliadwrus gyda monitro CT yn aml.
Yn seiliedig ar y metabolom dilys, fe wnaethom ddangos am y tro cyntaf y gorgyffwrdd rhwng llofnodion metabolomig rhwng unigolion iach a nodau diniwed <6 mm. Mae'r tebygrwydd biolegol yn gyson â chanfyddiadau CT blaenorol bod y risg o falaenedd ar gyfer nodau <6 mm mor isel ag ar gyfer pynciau heb nodau.30 Dylid nodi bod ein canlyniadau hefyd yn dangos bod gan nodau diniwed <6 mm a ≥6 mm debygrwydd uchel mewn proffiliau metabolomig, gan awgrymu bod y diffiniad swyddogaethol o etioleg diniwed yn gyson waeth beth fo maint y nodwl. Felly, gall paneli metabolyn serwm diagnostig modern ddarparu un assay fel prawf diystyru pan ganfyddir nodau i ddechrau ar CT ac o bosibl leihau monitro cyfresol. Ar yr un pryd, roedd yr un panel o fiomarcwyr metabolig yn gwahaniaethu rhwng nodau malaen ≥6 mm o ran maint a nodau diniwed ac yn darparu rhagfynegiadau cywir ar gyfer IPNs o faint tebyg a nodweddion morffolegol amwys ar ddelweddau CT. Perfformiodd y dosbarthwr metaboledd serwm hwn yn dda wrth ragweld malaenedd nodau ≥6 mm gydag AUC o 0.927. Gyda'i gilydd, mae ein canlyniadau'n dangos y gallai llofnodion metabolig serwm unigryw adlewyrchu newidiadau metabolaidd cynnar a achosir gan diwmorau yn benodol a bod ganddynt werth posibl fel rhagfynegwyr risg, yn annibynnol ar faint y nodwlau.
Yn arbennig, adenocarsinoma'r ysgyfaint (LUAD) a charsinoma celloedd cennog (LUSC) yw'r prif fathau o ganser yr ysgyfaint nad yw'n gell fach (NSCLC). O ystyried bod LUSC yn gysylltiedig yn gryf â defnyddio tybaco47 a LUAD yw'r histoleg fwyaf cyffredin o nodau ysgyfaint damweiniol a ganfyddir ar sgrinio CT48, adeiladwyd ein model dosbarthu yn benodol ar gyfer samplau adenocarsinoma cam I. Canolbwyntiodd Wang a'i gydweithwyr hefyd ar LUAD a nodi naw llofnod lipid gan ddefnyddio lipidomeg i wahaniaethu rhwng canser yr ysgyfaint cam cynnar ac unigolion iach17. Profon ni'r model dosbarthu cyfredol ar 16 achos o LUSC cam I a 74 o nodau diniwed a gwelsom gywirdeb rhagfynegi LUSC isel (AUC 0.776), gan awgrymu y gallai fod gan LUAD a LUSC eu llofnodion metabolomig eu hunain. Yn wir, dangoswyd bod LUAD a LUSC yn wahanol o ran etioleg, tarddiad biolegol ac aberiadau genetig49. Felly, dylid cynnwys mathau eraill o histoleg mewn modelau hyfforddi ar gyfer canfod canser yr ysgyfaint yn seiliedig ar y boblogaeth mewn rhaglenni sgrinio.
Yma, fe wnaethom nodi'r chwe llwybr a newidir amlaf mewn adenocarsinoma ysgyfaint o'i gymharu â rheolyddion iach a nodwlau diniwed. Mae xanthine a hypoxanthine yn fetabolion cyffredin o'r llwybr metabolaidd piwrin. Yn gyson â'n canlyniadau, roedd canolradd sy'n gysylltiedig â metaboledd piwrin wedi cynyddu'n sylweddol yn serwm neu feinweoedd cleifion ag adenocarsinoma ysgyfaint o'i gymharu â rheolyddion iach neu gleifion yn y cyfnod cyn-ymledol15,50. Gall lefelau uwch o xanthine a hypoxanthine serwm adlewyrchu'r anaboliaeth sydd ei hangen ar gelloedd canser sy'n amlhau'n gyflym. Mae camreoleiddio metaboledd glwcos yn nodwedd adnabyddus o fetaboledd canser51. Yma, gwelsom gynnydd sylweddol mewn pyruvate a lactate yn y grŵp LA o'i gymharu â'r grŵp HC a BN, sy'n gyson ag adroddiadau blaenorol o annormaleddau llwybr glycolytig ym mhroffiliau metabolom serwm cleifion canser yr ysgyfaint nad ydynt yn gelloedd bach (NSCLC) a rheolyddion iach. Mae'r canlyniadau'n gyson52,53.
Yn bwysig, gwelsom gydberthynas gwrthdro rhwng metaboledd pyruvat a tryptophan yn serwm adenocarsinomas yr ysgyfaint. Gostyngwyd lefelau tryptophan serwm yn y grŵp LA o'i gymharu â'r grŵp HC neu BN. Yn ddiddorol, canfu astudiaeth ar raddfa fawr flaenorol gan ddefnyddio cohort darpar fod lefelau isel o tryptophan sy'n cylchredeg yn gysylltiedig â risg uwch o ganser yr ysgyfaint 54. Mae tryptophan yn asid amino hanfodol a gawn yn gyfan gwbl o fwyd. Rydym yn dod i'r casgliad y gallai disbyddu tryptophan serwm mewn adenocarsinoma'r ysgyfaint adlewyrchu disbyddu cyflym y metabolyn hwn. Mae'n hysbys mai cynnyrch terfynol cataboliaeth tryptophan trwy'r llwybr kynurenine yw ffynhonnell synthesis NAD+ de novo. Gan fod NAD+ yn cael ei gynhyrchu'n bennaf trwy'r llwybr achub, mae pwysigrwydd NAD+ mewn metaboledd tryptophan mewn iechyd a chlefyd yn parhau i fod i'w benderfynu 46. Dangosodd ein dadansoddiad o gronfa ddata TCGA fod mynegiant y cludwr tryptophan 7A5 (SLC7A5) wedi cynyddu'n sylweddol mewn adenocarsinoma ysgyfaint o'i gymharu â rheolyddion arferol ac roedd yn gysylltiedig yn gadarnhaol â mynegiant yr ensym glycolytig GAPDH. Mae astudiaethau blaenorol wedi canolbwyntio'n bennaf ar rôl cataboliaeth tryptophan wrth atal yr ymateb imiwn gwrth-diwmor40,41,42. Yma rydym yn dangos bod atal amsugno tryptophan trwy ddileu SLC7A5 mewn celloedd canser yr ysgyfaint yn arwain at ostyngiad dilynol mewn lefelau NAD cellog a gwanhad cydredol o weithgaredd glycolytig. I grynhoi, mae ein hastudiaeth yn darparu sail fiolegol ar gyfer newidiadau mewn metaboledd serwm sy'n gysylltiedig â thrawsnewid malaen adenocarsinoma ysgyfaint.
Mwtaniadau EGFR yw'r mwtaniadau gyrrwr mwyaf cyffredin mewn cleifion â NSCLC. Yn ein hastudiaeth ni, gwelsom fod gan gleifion â mwtaniad EGFR (n = 41) broffiliau metabolig cyffredinol tebyg i gleifion ag EGFR math gwyllt (n = 31), er i ni ganfod lefelau serwm is mewn rhai cleifion â mwtaniad EGFR mewn cleifion asylcarnitin. Swyddogaeth sefydledig asylcarnitinau yw cludo grwpiau asyl o'r cytoplasm i'r matrics mitocondriaidd, gan arwain at ocsideiddio asidau brasterog i gynhyrchu ynni 55. Yn gyson â'n canfyddiadau ni, nododd astudiaeth ddiweddar broffiliau metabolom tebyg rhwng tiwmorau mwtaniad EGFR a thiwmorau math gwyllt EGFR trwy ddadansoddi metabolom byd-eang 102 o samplau meinwe adenocarsinoma'r ysgyfaint 50. Yn ddiddorol, canfuwyd cynnwys asylcarnitin hefyd yn y grŵp mwtaniad EGFR. Felly, a yw newidiadau mewn lefelau asylcarnitin yn adlewyrchu newidiadau metabolaidd a achosir gan EGFR a'r llwybrau moleciwlaidd sylfaenol, efallai y bydd angen astudiaeth bellach.
I gloi, mae ein hastudiaeth yn sefydlu dosbarthwr metabolaidd serwm ar gyfer diagnosis gwahaniaethol o nodau ysgyfeiniol ac yn cynnig llif gwaith a all optimeiddio asesiad risg a hwyluso rheolaeth glinigol yn seiliedig ar sgrinio sgan CT.
Cymeradwywyd yr astudiaeth hon gan Bwyllgor Moeseg Ysbyty Canser Prifysgol Sun Yat-sen, Ysbyty Cysylltiedig Cyntaf Prifysgol Sun Yat-sen, a Phwyllgor Moeseg Ysbyty Canser Prifysgol Zhengzhou. Yn y grwpiau darganfod a dilysu mewnol, casglwyd 174 o sera o unigolion iach a 244 o sera o nodau diniwlau gan unigolion a oedd yn cael archwiliadau meddygol blynyddol yn Adran Rheoli ac Atal Canser, Canolfan Canser Prifysgol Sun Yat-sen, a 166 o nodau diniwlau. Casglwyd adenocarsinomas ysgyfaint cam I o Ganolfan Canser Prifysgol Sun Yat-sen. Yn y garfan dilysu allanol, roedd 48 achos o nodau diniwlau, 39 achos o adenocarsinoma ysgyfaint cam I o Ysbyty Cysylltiedig Cyntaf Prifysgol Sun Yat-sen, a 24 achos o adenocarsinoma ysgyfaint cam I o Ysbyty Canser Zhengzhou. Casglodd Canolfan Canser Prifysgol Sun Yat-sen hefyd 16 achos o ganser yr ysgyfaint celloedd cennog cam I i brofi gallu diagnostig y dosbarthwr metabolig sefydledig (dangosir nodweddion cleifion yn Nhabl Atodol 5). Casglwyd samplau o'r garfan darganfod a'r garfan dilysu mewnol rhwng Ionawr 2018 a Mai 2020. Casglwyd samplau ar gyfer y garfan dilysu allanol rhwng Awst 2021 a Hydref 2022. Er mwyn lleihau rhagfarn rhyw, neilltuwyd niferoedd tua chyfartal o achosion gwrywaidd a benywaidd i bob carfan. Tîm Darganfod a Thîm Adolygu Mewnol. Penderfynwyd ar ryw'r cyfranogwyr yn seiliedig ar hunan-adrodd. Cafwyd caniatâd gwybodus gan bob cyfranogwr ac ni ddarparwyd unrhyw iawndal. Y pynciau â nodau anfalaen oedd y rhai â sgôr sgan CT sefydlog ar ôl 2 i 5 mlynedd ar adeg y dadansoddiad, ac eithrio 1 achos o'r sampl dilysu allanol, a gasglwyd cyn llawdriniaeth a'i ddiagnosio gan histopatholeg. Ac eithrio broncitis cronig. Casglwyd achosion adenocarsinoma'r ysgyfaint cyn echdorri'r ysgyfaint a'u cadarnhau gan ddiagnosis patholegol. Casglwyd samplau gwaed ymprydio mewn tiwbiau gwahanu serwm heb unrhyw wrthgeulyddion. Ceulwyd samplau gwaed am 1 awr ar dymheredd ystafell ac yna eu centrifugio ar 2851 × g am 10 munud ar 4°C i gasglu uwchnofiant serwm. Rhewwyd darnau o serwm ar -80°C nes bod y metabolyn yn cael ei echdynnu. Casglodd Adran Atal Canser ac Archwiliadau Meddygol Canolfan Canser Prifysgol Sun Yat-sen gronfa o serwm gan 100 o roddwyr iach, gan gynnwys nifer cyfartal o ddynion a menywod rhwng 40 a 55 oed. Cymysgwyd cyfeintiau cyfartal o bob sampl rhoddwr, rhannwyd y gronfa a ddeilliodd o hyn a'i storio ar -80°C. Defnyddiwyd y cymysgedd serwm fel deunydd cyfeirio ar gyfer rheoli ansawdd a safoni data.
Dadmerwyd y serwm cyfeirio a'r samplau prawf a thynnwyd y metabolion gan ddefnyddio dull echdynnu cyfun (MTBE/methanol/dŵr) 56. Yn gryno, cymysgwyd 50 μl o serwm â 225 μl o fethanol oerfel iâ a 750 μl o fethyl tert-bwtyl ether (MTBE) oerfel iâ. Trowch y cymysgedd a'i ddeori ar rew am 1 awr. Yna cymysgwyd y samplau a'u cymysgu â fortecs gyda 188 μl o ddŵr gradd MS yn cynnwys safonau mewnol (13C-lactad, 13C3-pyruvad, 13C-methionin, ac 13C6-isoleucine, a brynwyd gan Cambridge Isotope Laboratories). Yna cafodd y cymysgedd ei allgyrchu ar 15,000 × g am 10 munud ar 4 °C, a throsglwyddwyd y cyfnod isaf i ddau diwb (125 μL yr un) ar gyfer dadansoddiad LC-MS mewn moddau positif a negatif. Yn olaf, anweddwyd y sampl i sychder mewn crynodydd gwactod cyflym.
Ailgyfansoddwyd y metabolion sych mewn 120 μl o 80% asetonitril, eu troelli am 5 munud, a'u centrifugio ar 15,000 × g am 10 munud ar 4°C. Trosglwyddwyd uwchnofiannau i ffiolau gwydr ambr gyda microfewnosodiadau ar gyfer astudiaethau metabolomeg. Dadansoddiad metabolomeg heb ei dargedu ar blatfform cromatograffaeth hylif perfformiad uwch-sbectrometreg màs cydraniad uchel (UPLC-HRMS). Gwahanwyd metabolion gan ddefnyddio system Dionex Ultimate 3000 UPLC a cholofn ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters). Yn y modd ïon positif, y cyfnodau symudol oedd 95% (A) a 50% asetonitril (B), pob un yn cynnwys 10 mmol/L o asetat amoniwm a 0.1% asid fformig. Yn y modd negyddol, roedd cyfnodau symudol A a B yn cynnwys 95% a 50% asetonitril, yn y drefn honno, roedd y ddau gyfnod yn cynnwys 10 mmol/L o asetat amoniwm, pH = 9. Roedd y rhaglen graddiant fel a ganlyn: 0–0.5 munud, 2% B; 0.5–12 munud, 2–50% B; 12–14 munud, 50–98% B; 14–16 munud, 98% B; 16–16.1 munud, 98–2% B; 16.1–20 munud, 2% B. Cadwyd y golofn ar 40°C a'r sampl ar 10°C yn yr awtosampler. Roedd y gyfradd llif yn 0.3 ml/mun, a chyfaint y chwistrelliad oedd 3 μl. Gweithredwyd sbectromedr màs Orbitrap Q-Exactive (Thermo Fisher Scientific) gyda ffynhonnell ïoneiddio electrochwistrellu (ESI) mewn modd sgan llawn a'i gyplysu â'r modd monitro ddMS2 i gasglu cyfrolau mawr o ddata. Gosodwyd y paramedrau MS fel a ganlyn: foltedd chwistrellu +3.8 kV/- 3.2 kV, tymheredd capilarïaidd 320°C, nwy amddiffynnol 40 arb, nwy ategol 10 arb, tymheredd gwresogydd stiliwr 350°C, ystod sganio 70–1050 m/awr, datrysiad 70 000. Cafwyd data gan ddefnyddio Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Er mwyn asesu ansawdd data, cynhyrchwyd samplau rheoli ansawdd (QC) cronedig trwy dynnu 10 μL o'r uwchnofiant o bob sampl. Dadansoddwyd chwe phigiad sampl rheoli ansawdd ar ddechrau'r dilyniant dadansoddol i asesu sefydlogrwydd y system UPLC-MS. Yna cyflwynir samplau rheoli ansawdd i'r swp yn rheolaidd. Dadansoddwyd pob un o'r 11 swp o samplau serwm yn yr astudiaeth hon gan LC-MS. Defnyddiwyd aliquots o gymysgedd pwll serwm gan 100 o roddwyr iach fel deunydd cyfeirio mewn sypiau priodol i fonitro'r broses echdynnu ac addasu ar gyfer effeithiau swp-i-swp. Perfformiwyd dadansoddiad metabolomeg heb ei dargedu o'r garfan darganfod, y garfan dilysu mewnol, a'r garfan dilysu allanol yng Nghanolfan Metabolomeg Prifysgol Sun Yat-sen. Dadansoddodd labordy allanol Canolfan Dadansoddi a Phrofi Technoleg Prifysgol Guangdong 40 sampl o'r garfan allanol hefyd i brofi perfformiad y model dosbarthwr.
Ar ôl echdynnu ac ailgyfansoddi, mesurwyd meintioli absoliwt metabolion serwm gan ddefnyddio cromatograffaeth hylif perfformiad uwch-uchel-sbectrometreg màs tandem (Agilent 6495 triphlyg cwadrpol) gyda ffynhonnell ïoneiddio electrochwistrellu (ESI) mewn modd monitro adwaith lluosog (MRM). Defnyddiwyd colofn ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters) i wahanu metabolion. Roedd y cyfnod symudol yn cynnwys 90% (A) a 5% asetonitril (B) gyda 10 mmol/L o asetat amoniwm a hydoddiant 0.1% amonia. Roedd y rhaglen graddiant fel a ganlyn: 0–1.5 munud, 0% B; 1.5–6.5 munud, 0–15% B; 6.5–8 munud, 15% B; 8–8.5 munud, 15%–0% B; 8.5–11.5 munud, 0%B. Cadwyd y golofn ar 40 °C a'r sampl ar 10 °C yn yr awtosampler. Roedd y gyfradd llif yn 0.3 mL/mun a'r gyfaint chwistrellu yn 1 μL. Gosodwyd paramedrau MS fel a ganlyn: foltedd capilarïaidd ±3.5 kV, pwysedd nebiwlydd 35 psi, llif nwy gwain 12 L/mun, tymheredd nwy gwain 350 °C, tymheredd nwy sychu 250 °C, a llif nwy sychu 14 l/mun. Roedd y trawsnewidiadau MRM o tryptoffan, pyruvat, lactad, hypoxanthine a xanthine yn 205.0–187.9, 87.0–43.4, 89.0–43.3, 135.0–92.3 a 151.0–107.9 yn y drefn honno. Casglwyd data gan ddefnyddio Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). Ar gyfer samplau serwm, meintioliwyd tryptophan, pyruvate, lactate, hypoxanthine, a xanthine gan ddefnyddio cromliniau calibradu o doddiannau cymysgedd safonol. Ar gyfer samplau celloedd, normaleiddiwyd cynnwys tryptophan i'r safon fewnol a màs protein y gell.
Perfformiwyd echdynnu brig (m/z ac amser cadw (RT)) gan ddefnyddio Compound Discovery 3.1 a TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Er mwyn dileu gwahaniaethau posibl rhwng sypiau, rhannwyd pob brig nodweddiadol o'r sampl prawf â brig nodweddiadol y deunydd cyfeirio o'r un swp i gael y helaethrwydd cymharol. Dangosir y gwyriadau safonol cymharol o safonau mewnol cyn ac ar ôl safoni yn Nhabl Atodol 6. Nodweddwyd y gwahaniaethau rhwng y ddau grŵp gan gyfradd darganfod ffug (FDR<0.05, prawf rheng wedi'i lofnodi gan Wilcoxon) a newid plyg (>1.2 neu <0.83). Dangosir data MS crai o'r nodweddion a echdynnwyd a data MS wedi'i gywiro gan serwm cyfeirio yn Data Atodol 1 a Data Atodol 2, yn y drefn honno. Perfformiwyd anodi brig yn seiliedig ar bedwar lefel adnabod diffiniedig, gan gynnwys metabolion a nodwyd, cyfansoddion a anodir yn dybiedig, dosbarthiadau cyfansoddion a nodweddir yn dybiedig, a chyfansoddion anhysbys 22. Yn seiliedig ar chwiliadau cronfa ddata yn Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), dewiswyd cyfansoddion biolegol gyda safonau dilys cyfatebol MS/MS neu anodiadau cyfatebol union yn mzCloud (sgôr > 85) neu Chemspider yn y pen draw fel canolradd rhwng y metabolom gwahaniaethol. Mae anodiadau brig ar gyfer pob nodwedd wedi'u cynnwys yn Data Atodol 3. Defnyddiwyd MetaboAnalyst 5.0 ar gyfer dadansoddiad unnewidyn o helaethrwydd metabolyn wedi'i normaleiddio yn ôl swm. Gwerthusodd MetaboAnalyst 5.0 hefyd ddadansoddiad cyfoethogi llwybr KEGG yn seiliedig ar fetabolion gwahanol iawn. Dadansoddwyd dadansoddiad cydrannau pennaf (PCA) a dadansoddiad gwahaniaethol sgwariau lleiaf rhannol (PLS-DA) gan ddefnyddio'r pecyn meddalwedd ropls (v.1.26.4) gyda normaleiddio pentwr ac awto-raddio. Cynhyrchwyd y model biomarcwr metabolyn gorau posibl ar gyfer rhagweld malaenedd nodau gan ddefnyddio atchweliad logistaidd deuaidd gyda'r crebachiad absoliwt lleiaf a gweithredwr dethol (LASSO, pecyn R v.4.1-3). Nodweddwyd perfformiad y model gwahaniaethol yn y setiau canfod a dilysu trwy amcangyfrif AUC yn seiliedig ar ddadansoddiad ROC yn ôl y pecyn pROC (v.1.18.0.). Cafwyd y torbwynt tebygolrwydd gorau posibl yn seiliedig ar fynegai Youden uchaf y model (sensitifrwydd + penodolrwydd – 1). Bydd samplau â gwerthoedd llai neu fwy na'r trothwy yn cael eu rhagweld fel nodau diniwed ac adenocarsinoma ysgyfaint, yn y drefn honno.
Tyfwyd celloedd A549 (#CCL-185, Casgliad Diwylliant Math Americanaidd) mewn cyfrwng F-12K yn cynnwys 10% FBS. Mewnosodwyd dilyniannau RNA pin gwallt byr (shRNA) yn targedu SLC7A5 a rheolaeth nad yw'n targedu (NC) i'r fector lentiviral pLKO.1-puro. Dyma ddilyniannau gwrth-synnwyr shSLC7A5: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Prynwyd gwrthgyrff i SLC7A5 (#5347) a thiwbwlin (#2148) gan Cell Signaling Technology. Defnyddiwyd gwrthgyrff i SLC7A5 a thiwbwlin ar wanhad o 1:1000 ar gyfer dadansoddiad blot Gorllewinol.
Mae Prawf Straen Glycolytig Seahorse XF yn mesur lefelau asideiddio allgellog (ECAR). Yn yr assay, rhoddwyd glwcos, oligomycin A, a 2-DG yn olynol i brofi capasiti glycolytig cellog fel y'i mesurwyd gan ECAR.
Cafodd celloedd A549 a drawsffectiwyd â rheolaeth nad yw'n dargedu (NC) a shSLC7A5 (Sh1, Sh2) eu platio dros nos mewn dysglau 10 cm mewn diamedr. Cafodd metabolion celloedd eu tynnu gydag 1 ml o fethanol dyfrllyd 80% oerfel rhewllyd. Cafodd celloedd yn y toddiant methanol eu crafu i ffwrdd, eu casglu i diwb newydd, a'u centrifugio ar 15,000 × g am 15 munud ar 4°C. Casglwch 800 µl o uwchnofiant a'i sychu gan ddefnyddio crynodydd gwactod cyflym. Yna dadansoddwyd y pelenni metabolyn sych am lefelau tryptoffan gan ddefnyddio LC-MS/MS fel y disgrifiwyd uchod. Mesurwyd lefelau NAD(H) cellog mewn celloedd A549 (NC a shSLC7A5) gan ddefnyddio pecyn colorimetrig meintiol NAD+/NADH (#K337, BioVision) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Mesurwyd lefelau protein ar gyfer pob sampl i normaleiddio faint o fetabolion.
Ni ddefnyddiwyd unrhyw ddulliau ystadegol i bennu maint y sampl yn rhagarweiniol. Ystyriwyd astudiaethau metabolomeg blaenorol a anelir at ddarganfod biomarcwyr15,18 fel meincnodau ar gyfer pennu maint, ac o'u cymharu â'r adroddiadau hyn, roedd ein sampl yn ddigonol. Ni chafodd unrhyw samplau eu heithrio o'r garfan astudio. Neilltuwyd samplau serwm ar hap i grŵp darganfod (306 o achosion, 74.6%) a grŵp dilysu mewnol (104 o achosion, 25.4%) ar gyfer astudiaethau metabolomeg heb eu targedu. Dewiswyd 70 o achosion ar hap hefyd o bob grŵp o'r set ddarganfod ar gyfer astudiaethau metabolomeg wedi'u targedu. Cafodd yr ymchwilwyr eu dallu i aseiniad grŵp yn ystod casglu a dadansoddi data LC-MS. Disgrifir dadansoddiadau ystadegol o ddata metabolomeg ac arbrofion celloedd yn yr adrannau Canlyniadau, Chwedlau Ffigur, a Dulliau priodol. Perfformiwyd meintioli tryptoffan cellog, NADT, a gweithgaredd glycolytig dair gwaith yn annibynnol gyda chanlyniadau union yr un fath.
Am ragor o wybodaeth am gynllun yr astudiaeth, gweler Crynodeb Adroddiad Portffolio Naturiol sy'n gysylltiedig â'r erthygl hon.
Dangosir y data MS crai o'r nodweddion a echdynnwyd a'r data MS wedi'i normaleiddio o'r serwm cyfeirio yn Data Atodol 1 a Data Atodol 2, yn y drefn honno. Cyflwynir anodiadau brig ar gyfer nodweddion gwahaniaethol yn Data Atodol 3. Gellir lawrlwytho set ddata LUAD TCGA o https://portal.gdc.cancer.gov/. Darperir y data mewnbwn ar gyfer plotio'r graff yn y data ffynhonnell. Darperir data ffynhonnell ar gyfer yr erthygl hon.
Grŵp Astudiaeth Sgrinio Ysgyfaint Cenedlaethol, ac ati. Lleihau marwolaethau o ganser yr ysgyfaint gyda thomograffeg gyfrifiadurol dos isel. Gogledd Lloegr. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR a Prophet, PC Sgrinio canser yr ysgyfaint gan ddefnyddio CT heligol dos isel: canlyniadau o'r Astudiaeth Sgrinio Ysgyfaint Genedlaethol (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al. Lleihau marwolaethau canser yr ysgyfaint gyda sgrinio CT folwmetrig mewn treial ar hap. Gogledd Lloegr. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Amser postio: Medi-18-2023