CRISPR) yn dechneg golygu genom trydydd genhedlaeth: chwyldroodd CRISPR y byd

Mae ailadroddiadau palindromig byr rhyng-gysylltiedig yn rheolaidd wedi'u clwsterio (CRISPR) yn dechneg golygu genom trydydd genhedlaeth sydd wedi chwyldroi'r byd gyda'i chanlyniadau trwybwn uchel. Fe'i defnyddiwyd i drin amrywiol glefydau a heintiau biolegol. Mae gan amrywiol facteria a phrocaryotau eraill (fel archaea) systemau CRISPR/Cas9 hefyd i amddiffyn rhag ffagau. Adroddwyd y gall strategaethau sy'n seiliedig ar CRISPR/Cas9 atal twf a dilyniant canser y fron triphlyg negatif (TNBC) trwy dargedu genynnau ymwrthedd, trawsgrifiad a rheoleiddio epigenetig a allai fod wedi'u newid. Gall yr ymyriadau therapiwtig hyn helpu i fynd i'r afael â phroblemau heriol fel ymwrthedd i gyffuriau a welir hyd yn oed mewn TNBC. Ar hyn o bryd, defnyddir amrywiol ddulliau i gyflwyno CRISPR/Cas9 i gelloedd targed, megis gronynnau corfforol (microchwistrelliad, electroporation a dulliau hydrodynamig), firaol (feirws sy'n gysylltiedig ag adeno a lentifirws) ac anfeirysol (liposomau a nanoronynnau lipid). Er bod amrywiol fodelau wedi'u datblygu i astudio achosion moleciwlaidd TNBC, mae diffyg dulliau sensitif a thargedig ar gyfer cyflwyno offer golygu genom in vivo yn cyfyngu ar eu cymhwysiad clinigol. I grynhoi, mae'r adolygiad hwn yn archwilio'n gynhwysfawr gynnydd, heriau, cyfyngiadau a rhagolygon triniaeth CRISPR/Cas9 ar gyfer TNBC yn seiliedig ar dystiolaeth bresennol. Rydym hefyd yn tynnu sylw at sut y gall y cyfuniad o ddeallusrwydd artiffisial a dysgu peirianyddol wella strategaethau CRISPR/Cas9 wrth drin TNBC.
Nodweddir canser gan raniad celloedd afreolus, tarfu ar bwyntiau gwirio cylchred celloedd, a mwtaniadau mewn genynnau atalydd tiwmor (TSGs) (Matthews et al., 2022). Ymhlith y gwahanol fathau o ganser, canser y fron yw'r math mwyaf cyffredin o ganser mewn menywod ac mae ganddo gyfradd marwolaethau uchel ledled y byd (Waks a Winer, 2019). Mae canser y fron yn glefyd heterogenaidd gyda nodweddion amrywiol, megis nodweddion histolegol a biolegol, cyflwyniad clinigol ac ymddygiad, ac ymateb i driniaeth (Weigelt et al., 2010). Mae dosbarthu canser y fron yn darparu mewnwelediadau manwl gywir ar gyfer diagnosis canser y fron a prognosis tiwmor. Defnyddio biomarcwyr cyffredin a nodweddion clinigopatholegol fu'r prif faen prawf ar gyfer dosbarthu canser y fron (Tsang a Tse, 2019). Mae prognosis ac ymateb i driniaeth canser y fron yn cael eu dylanwadu gan nifer o ffactorau, gan gynnwys presenoldeb derbynnydd estrogen (ER), derbynnydd progesteron (PR), derbynnydd ffactor twf epidermaidd dynol 2 (HER2/neu), a gradd histolegol, math o diwmor, a gradd. maint a metastasis nodau lymff (Al-Tubaiti, 2020). Mae pum isdeip moleciwlaidd cynhenid ​​​​o ganser y fron wedi'u nodi, gan gynnwys luminal A, luminal B, wedi'i gyfoethogi â HER2, tebyg i fasal, a claudin-isel (Prat et al., 2015). Mae TNBC yn isdeip moleciwlaidd o ganser nad yw'n mynegi pob ER, PR, a HER2 (Yin et al., 2020). Mae'r nodweddion patholegol hyn yn gysylltiedig â TNBC, gan gadarnhau ei ddatblygiad cyflym a'i natur fwy ymosodol nag unrhyw fath arall o ganser y fron (Feng et al., 2018). Yn ogystal, defnyddiodd Peru et al (2000) dechnoleg microarray i ailddosbarthu canser y fron a nodi pum isdeip cynhenid ​​​​o ganser y fron (Cadenas, 2012). Mae canser y fron tebyg i fasal yn isdeip o ganser y fron sydd â ffenoteip triphlyg-negatif ac sy'n gysylltiedig â datblygiad cyflym. Dylid nodi bod pob canser y fron tebyg i'r gwaelod yn aml yn cael diagnosis anghywir fel TNBC, ond dim ond 77% ohonynt sy'n TNBC; I'r gwrthwyneb, mae 71–91% o TNBC yn debyg i'r gwaelod, sy'n dangos bod y ddau fath hyn o ganser y fron yn gorgyffwrdd ac yn cynrychioli gwahanol ddosbarthiadau (Wang D.-Y. et al., 2019). Mae hyn yn creu angen i nodweddu amrywioldeb TNBC i egluro prognosis a nodi ymatebion posibl i driniaethau cyfredol a thriniaethau yn y dyfodol. Yn ogystal, mae TNBC yn cyfrif am 15–20% o'r holl achosion o ganser y fron ac mae'n fwy cyffredin mewn menywod o dan 50 oed. Mae mwtaniadau BRCA1 neu BRCA2 wedi'u hadrodd mewn tua 20% o achosion TNBC (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017, 2020). Mae astudiaethau hefyd wedi dangos bod gan TNBC ficroamgylchedd imiwnedd penodol sy'n cynnwys lefelau uchel o ffactorau twf endothelaidd fasgwlaidd, macroffagau sy'n gysylltiedig â thiwmorau (TAMs), lymffocytau sy'n treiddio i diwmorau (TILs), a moleciwlau eraill sy'n ymwneud â thwf a mudo tiwmorau. Felly, mae deall microamgylchedd TNBC yn hanfodol ar gyfer ei prognosis a'i driniaeth (Fan a He, 2022).
Er mwyn asesu prognosis TNBC a sicrhau triniaeth effeithiol, mae diagnosis cywir, yn seiliedig yn bennaf ar imiwnohistochemeg (IHC) i ganfod ER, PR a HER2, a mamograffeg i ganfod neoplasmau'r fron, yn bwysig. Fodd bynnag, ni all mamograffeg ddarlunio nodweddion mewngwthiol fel necrosis a ffibrosis yn ddigonol (Deepak Singh et al., 2021). Gan fod prognosis a diagnosis gwael yn atal meddygon rhag rhagnodi'r meddyginiaethau cywir (Chaudhary, 2020), defnyddir amrywiol strategaethau i wella gofal i gleifion â TNBC. Ar hyn o bryd, defnyddir dau gyffur, doxorubicin a cyclophosphamide, mewn cleifion â TNBC ac maent wedi dangos canlyniadau da. Yn ogystal, defnyddir cyffuriau platinwm eraill, fel carboplatin a cisplatin (Sikov et al., 2015). Yn ogystal, defnyddiwyd atalyddion PARP fel Olaparib, Velaparib, a PF-01367338 fel cyffuriau cemotherapi posibl ar gyfer trin TNBC (Ishino et al., 2018). Gan fod llwybrau signalau Wnt/b-Catenin, NOTCH, a Hedgehog wedi'u hadrodd fel rhai sy'n rhan o ddigwyddiad a datblygiad TNBC, gall targedu cyffuriau at y llwybrau hyn fod yn strategaeth bwysig (Aysola et al., 2013). Er bod llawdriniaeth, therapi ymbelydredd a chemotherapi yn parhau i fod yn brif driniaeth ar gyfer TNBC heddiw, mae cynnydd sylweddol wedi'i wneud wrth ddatblygu triniaethau newydd gan gynnwys therapi wedi'i dargedu, imiwnotherapi, amrywiol offer golygu genynnau sy'n gysylltiedig â CRISPR fel Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, golygu sylfaenol, a therapi genynnau wedi'i dargedu at CRISPR/Cas9. Yma, byddwn yn canolbwyntio ar amrywiol offer golygu genynnau sy'n gysylltiedig â CRISPR a ddefnyddir wrth drin TNBC. Yn eu plith, mae CRISPR/Cas9 wedi derbyn sylw eang.
Mae Cas9n, a elwir hefyd yn niccase Cas9, yn amrywiad wedi'i beiriannu'n enetig o'r protein Cas9 sy'n deillio o'r system golygu genom CRISPR/Cas9 (Gupta et al., 2019). Yn ei ffurf wreiddiol, mae'r protein Cas9 yn cynnwys dau barth niwcleas: RuvC a HNH, a'u prif swyddogaeth yw hollti'r ddau linyn DNA. Fodd bynnag, yn Cas9n, mae un o'r parthau niwcleas, HNH, wedi'i dreiglo'n enetig ac yn dod yn anactif. Felly, mae parth HNH Cas9n yn parhau i fod yn anweithredol. Dim ond y parth RuvC sy'n parhau i fod yn weithredol, gan ganiatáu i Cas9n dorri neu greu toriadau ar linynnau DNA sengl (Trevino a Zhang, 2014). O'i gymharu â Cas9, gall Cas9n leihau effeithiau oddi ar y targed yn effeithiol a gwella mecanweithiau atgyweirio celloedd yn gywir. Gellir defnyddio Cas9n i ddatrys amrywiol broblemau, megis creu toriadau mewn lleoliadau penodol mewn DNA llinyn dwbl. At y diben hwn, cyfunwyd dau foleciwl Cas9n a'u defnyddio gyda'i gilydd (Yee, 2016). Mae kinase llinach gymysg 3 (MLK3) yn kinase protein sy'n cael ei actifadu gan mitogen sy'n gwasanaethu fel rheolydd allweddol yn ystod metastasis TNBC (Cronan et al., 2012).
Gall MLK3 actifadu llwybrau signalau lluosog sy'n arwain at fetastasis TNBC. Er enghraifft, mae'r llwybr kinase N-derfynol c-Jun (JNK) yn rheoleiddio symudedd celloedd a diraddio matrics allgellog, ac mae MLK3 yn actifadu'r llwybr JNK, gan wella symudedd celloedd a rhoi priodweddau ymledol iddynt (Rattanasinchai a Gallo, 2016). Mae MLK3 hefyd yn rheoleiddio EMT. I wneud hyn, mae'n actifadu ffactorau trawsgrifio i lawr yr afon fel Snail, Slug a Twist. Mae'r ffactorau hyn yn atal mynegiant marcwyr epithelaidd ac yn hyrwyddo mynegiant marcwyr mesenchymal, gan arwain at gaffael ffenoteip metastatig (Casalino et al., 2023). Gwelwyd bod MLK3 yn chwarae rhan mewn ailfodelu ECM ac actifadu proteasau fel metalloproteinasau matrics (MMPs) sy'n diraddio'r ECM. Mae hyn yn hwyluso goresgyniad celloedd tiwmor a lledaeniad i safleoedd pell (Katari et al., 2019). Felly, mae astudiaethau blaenorol wedi dangos bod MLK3 yn chwarae rhan hanfodol yn TNBC. Defnyddiodd Rattanasinchai a Gallo fodelau TNBC i astudio rôl MLK3 a chanfod ei fod yn hyrwyddo datblygiad canser trwy lwybrau signalau penodol. Defnyddiasant CRISPR/Cas9n i olygu MLK3 a gweld gostyngiad sylweddol mewn metastasis TNBC (Rattanasinchai a Gallo, 2016).
Mae dCas9, a elwir yn aml yn Cas9 anactif, yn ffurf ddeilliadol wedi'i haddasu o'r protein Cas9. Yn wahanol i Cas9 gweithredol, mae diffyg gweithgaredd endoniwcleas yn dCas9, sy'n ei wneud yn analluog i ysgogi toriadau llinyn dwbl DNA. Felly, gellir defnyddio dCas9 i dargedu rhanbarthau penodol o'r genom yn fanwl gywir heb unrhyw newidiadau na haddasiadau i ddilyniant y DNA (Wang et al., 2016). Yn dCas9, mae dau brotein endoniwcleas, RuvC a HNH, yn cael eu hanactifadu trwy atal gweddillion asid amino pwysig. (Richter et al., 2016). Er gwaethaf ei ddiffyg gweithgaredd hollti DNA, mae dCas9 yn chwarae nifer o rolau pwysig mewn ymchwil genetig a biodechnoleg. Er enghraifft, mae'n caniatáu delweddu rhanbarthau penodol o'r genom, yn hwyluso rheoleiddio trawsgrifio, ac yn hyrwyddo addasiadau epigenetig (Brocken et al., 2018).
Mae'r ffactor trawsgrifio ZEB1 (sinc bys E-box bonding homeobox 1) yn chwarae rhan benodol a hanfodol wrth gyfryngu'r trawsnewidiad epithelaidd-mesenchymal (EMT), proses gellog sy'n digwydd yn ystod datblygiad embryonig, atgyweirio meinwe, a datblygiad canser. Mae'n cynnwys trawsnewid celloedd epithelaidd yn gelloedd mesenchymal, gan arwain at newidiadau mewn morffoleg celloedd, symudedd, ymledolrwydd, ac ati. (Wu et al., 2020). Mae ZEB1 yn atal nifer o farciau epithelaidd, fel E-cadherin ac Occludin, sy'n gyfrifol am gynnal adlyniad cell-gell a pholaredd celloedd epithelaidd mewn TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). Yn ogystal, mae ZEB1 yn actifadu rhai marcwyr fel N-cadherin, vimentin a fibronectin (Konradi et al., 2014) ac mae hefyd yn rheoleiddio genynnau sy'n ymwneud ag ailfodelu cytosgerbydol fel Rho GTPases a matrics metalloproteinases (MMPs) (Huang). et al., 2014). 2022), yn ogystal, mae hefyd yn effeithio ar amrywiol lwybrau signalau megis ffactor twf trawsnewidiol-β (TGF-β), signalau Wnt, ac ati, a thrwy hynny hyrwyddo goresgyniad tiwmor a metastasis mewn TNBC (Chen et al., 2016). Mae nifer o astudiaethau a thystiolaeth wyddonol yn dangos bod gan ZEB1 botensial mawr fel asiant gwerthfawr ar gyfer canfod ac ymyrraeth therapiwtig TNBC. Mewn astudiaeth ddiweddar, defnyddiodd Waryah et al. fodel TNBC a chyflawni ataliad llwyr o ZEB1 gan dCas9. Felly, fe wnaethant arsylwi penodolrwydd uchel iawn ac ataliad bron yn llwyr o ZEB1 mewn amodau in vivo (Waryah et al., 2023).
Mae CRISPR/Cas12 yn offeryn golygu genynnau o'r enw CRISPR/Cpf1. Mae'n deillio o'r system CRISPR/Cas, lle mae'r term Cas12 yn cyfeirio at brotein 12 sy'n gysylltiedig â CRISPR (Bharathkumar et al., 2022), sy'n gwbl debyg i Cas9. Yr unig wahaniaeth yw ei fod yn cynnwys y protein Cas12. O'i gymharu â Cas9, mae gan Cas12 rai swyddogaethau unigryw megis cynhyrchu pennau gludiog yn ystod y broses golygu genynnau, tra bod Cas9 yn cynhyrchu pennau pŵl (Wang et al., 2021). Mae'r priodwedd hon o Cas12 yn cyfrannu at ei dechnoleg trin DNA benodol. Fel protein sy'n gallu adnabod a thorri DNA targed yn fanwl gywir, mae ganddo hyblygrwydd rhyfeddol, gan ei wneud yn offeryn effeithiol ar gyfer amrywiaeth o gymwysiadau, gan gynnwys golygu genynnau (Pickar-Oliver a Gersbach, 2019).
Yn debyg i amrywiadau CRISPR eraill, mae CRISPR/Cas12 hefyd yn gallu dileu neu actifadu genynnau mewn TNBC, gan dargedu genynnau sy'n chwarae rhan bwysig yn ei bathogenesis neu ymateb i driniaeth (Yang a Zhang, 2023). I gyflawni'r broses hon, datblygwyd RNA canllaw (gRNA) sy'n cyfeirio Cas12 at y genyn targed. Unwaith y bydd Cas12 yn rhwymo i'w darged, mae'n cyflwyno toriadau llinyn dwbl yn y DNA ac yn actifadu mecanweithiau atgyweirio DNA. Yn ystod y broses atgyweirio, gellir ymgorffori niwcleotidau anghywir, gan arwain at dreigladau genynnau a cholli swyddogaeth (Zhang et al., 2021a). Yn ogystal, defnyddiwyd fersiwn well o'r ensym Cas12 (a elwir yn dCas12) hefyd i actifadu genynnau. Trwy ei gyfuno ag actifadu trawsgrifio, mae'n bosibl ysgogi rhai genynnau, a thrwy hynny eu actifadu. Mae gan y dechnoleg hon botensial mawr i hyrwyddo actifadu genynnau atalydd tiwmor (Sultan et al., 2022).
Mae golygu sylfaenol yn dechnoleg golygu genom sydd newydd ei datblygu ac sy'n hynod uwchraddol. Mae'n gallu addasu DNA organeb yn fanwl iawn (Chen a Liu, 2023). Cyflawnir golygu sylfaenol trwy integreiddio dau brif gydran: ensym CRISPR/Cas9 wedi'i addasu a thranscriptase gwrthdro. Rôl yr ensym CRISPR/Cas9 yw targedu safleoedd manwl gywir yn y genom yn ddetholus, tra bod trawsgrifiad gwrthdro yn helpu i addasu'r DNA yn drylwyr yn y lleoliad targed (Hassan et al., 2021). Yn y mecanwaith golygu primer, mae'r cam cyntaf yn cynnwys creu RNA canllaw golygu primer (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Mae'n cynnwys y dilyniant targed a'r templed RNA sy'n cyfateb i'r safle golygu a ddymunir yn y DNA targed. Yna cyflwynir y pegRNA i'r celloedd targed ynghyd â niwcleas golygu primer (PE2). Mae PE2 yn brotein cyfuno sy'n cynnwys ensym Cas9, trawsgrifiad gwrthdro, ac addasydd golygu primer (Martín-Alonso et al., 2021). Y tu mewn i'r gell, mae cyfadeiladau pegRNA a PE2 yn chwilio am y DNA penodol y maent am ei addasu. Mae'r ensym Cas9 yn torri DNA ac yn creu templed sy'n cynnwys llinynnau sengl (Choi et al., 2022). Mae trawsgrifiad gwrthdro yn defnyddio'r templed hwn i baratoi'r DNA ar gyfer golygu. Ynghyd â chopïo DNA, mae cyfarwyddiadau ar gyfer golygu'r templed RNA hefyd wedi'u cynnwys. Yn olaf, defnyddir y llinyn DNA newydd ei greu fel templed i atgyweirio'r toriad yn y DNA, gan arwain at ddilyniant DNA wedi'i newid sy'n cynnwys yr addasiad a ddymunir (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Gall mecanweithiau golygu primer arwain at dreigladau eang mewn genynnau. Gall dargedu mwtaniadau pwynt, mewnosodiadau, dileuadau, a hyd yn oed amnewidiadau genynnau (Anzalone et al., 2019; Chen a Liu, 2023). Mae golygu primer yn cynnig sawl mantais dros dechnolegau golygu genom blaenorol. Mae'r rhain yn cynnwys cywirdeb cynyddol, llai o effeithiau oddi ar y targed, a'r gallu i olygu DNA heb ddibynnu ar doriadau llinyn dwbl DNA (Anzalone et al., 2020).
Datblygwyd technoleg CRISPR/Cas9 yn wreiddiol i amddiffyn bacteria rhag trosglwyddo plasmid a haint ffag ac fe'i hail-bwrpaswyd yn ddiweddarach fel offeryn targedu DNA effeithiol yn seiliedig ar RNA ar gyfer golygu genom (Jiang a Doudna, 2017). Yn ogystal, adroddwyd bod y system CRISPR/Cas9 yn bresennol mewn 50% ac 87% o genom bacteriol ac archeol, yn y drefn honno (Ishino et al., 2018). Mae CRISPR/Cas9 yn offeryn posibl ar gyfer dileu, mewnosod a chywiro unrhyw ddilyniant genetig annormal gan ddefnyddio dulliau in vivo ac in vitro (Sabit et al., 2021). Ar ben hynny, dangoswyd bod CRISPR/Cas9 yn rhan o'r system imiwnedd addasol oherwydd ei benodolrwydd ar gyfer genynnau targed o ddiddordeb (Chen a Zhang, 2018).
Mae CRISPR/Cas9 yn cynnwys Cas9 ac un RNA canllaw (sgRNA). Mae Cas9 yn endoniwcleas sy'n cynnwys nifer o gydrannau protein. Yn ogystal, mae gan Cas9 briodweddau strwythurol a chyfluniadol unigryw (Pacesa et al., 2022) gan ei fod yn cynnwys dau labed: adnabyddiaeth (REC) a niwcleas (NUC). Mae'r labed REC wedi'i rhannu ymhellach yn dair rhanbarth: REC1, REC2, a helices pont (Cromwell et al., 2018). Mae'r NUC yn cynnwys tair labed, sef RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH a'r parth rhyngweithio motiff cyfagos protospacer (PAM) (Ffig. 1) (Song et al., 2016). Mae sgRNA yn cynnwys dau gydran, gan gynnwys RNA CRISPR (crRNA) ac RNA bach trawsgodio (RNA olrhain) (Ffigur 1). Mae'r sgRNA yn cysylltu'r protein Cas9 â chonnexinau i ffurfio cymhlyg gweithredol, a elwir hefyd yn gymhlyg effeithiol (Richter et al., 2012). Mae crRNA yn bâr sylfaen 18–20 niwcleotid sy'n chwarae rhan hanfodol wrth adnabod dilyniannau DNA targed. Yn ogystal, mae crRNA yn paru â'r DNA targed, ac mae tracrRNA yn gweithredu fel sgaffald i'r niwcleas Cas9 rwymo'r DNA targed (Manghwar et al., 2019). Ar y llaw arall, mae gan y dilyniant PAM 3 niwcleotid, sy'n cadarnhau, yn pennu ac yn cyfryngu rhwymiad y cymhlyg effeithiol i DNA. Mae gan is-unedau cymhlyg protein Cas9 RuvC a HNH weithgaredd catalytig (Richter et al., 2012; Asmamaw a Zawdie, 2021). Mae parth niwcleas HNH yr is-uned Cas9 yn hollti'r llinyn DNA sy'n gysylltiedig â'r crRNA. Mae parth niwcleas RuvC yn hollti llinynnau DNA eraill ac yn cynhyrchu toriadau llinyn dwbl (DSBs), ac ar ôl hynny mae dau fecanwaith atgyweirio toriadau DNA gwahanol yn cael eu actifadu (Jiang a Doudna, 2017) (Ffigur 1).
Ffigur 1. Trosolwg o CRISPR/Cas9 (A). Cydrannau'r system CRISPR/Cas9: (i). Mae endoniwcleas Cas9 yn gyfrifol am dorri'r dilyniant DNA targed, (ii) RNA canllaw sengl (sg) sy'n deillio o gyfuno cimeras crRNA a tra-crRNA. (dau). Mae Cas9 yn cynnwys sawl cydran megis Rec I, Rec II, llabed NUC (mae HNH a Ruv C yn is-gydrannau) a pharth rhyngweithio PAM (C) gyda swyddogaethau cyfatebol. Mae'r cymhlyg protein CRISPR/Cas9 yn hollti dilyniannau DNA yn ffurfiau anghyflenwol a chyflenwol (D). Mae CRISPR/Cas9 yn golygu'r genom mewn tair cam: adnabod, torri ac atgyweirio. Mae'r sg-RNA a gynlluniwyd yn tywys Cas9 ac yn adnabod y dilyniant a ddymunir trwy'r gydran gyflenwol crRNA. Mae Cas9 yn adnabod y dilyniant PAM yn 5′-NGG-3′ ac yn toddi'r DNA, gan ffurfio hybrid DNA-RNA ac actifadu hollti. Mae parth HNH Cas9 yn hollti'r llinyn cyflenwol, ac mae parth RuvC yn hollti'r llinyn anghyflenwol. Mae CRISPR/Cas9 yn atgyweirio DNA dwbl trwy ei dorri mewn dwy ffordd: ymuno â phen nad yw'n homologaidd (NHEJ) ac atgyweirio dan gyfeirio homologaeth (HDR). Mae NHEJ yn atgyweirio DNA llinyn dwbl yn absenoldeb DNA homologaidd tramor trwy broses ensymatig, mecanwaith sy'n dueddol o wneud gwallau a all fewnosod neu dynnu dilyniannau DNA ar hap. Mae HDR yn benodol iawn ac mae angen templedi DNA homologaidd arno.
Mae llwybrau atgyweirio a gyfryngir gan CRISPR/Cas9 yn cynnwys mecanweithiau ymuno diwedd anhomologaidd (NHEJ) ac atgyweirio a gyfeirir gan homologi (HDR). Mae NHEJ yn llwybr sy'n dueddol o wneud gwallau oherwydd ei fod yn cynnwys mewnosod neu ddileu ac nid oes angen unrhyw batrwm yn ystod y mecanwaith atgyweirio. Mae'n defnyddio niwcleotidau ar hap i gynhyrchu proteinau safonol (Abbasi et al., 2021). Mae'r system atgyweirio hon yn cynnwys pedwar cymhlyg megis y cymhlyg KU, y cymhlyg protein traws-gyflenwol math 4 (XRCC-4), yr ensym prosesu diwedd DNA, a'r protein kinase DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). Mae gan y protein cymhlyg KU ddau is-uned, Ku 70 a Ku 80, ac mae'n chwarae rhan bwysig ym mecanwaith NHEJ, gan fod y mecanwaith atgyweirio yn cael ei gychwyn trwy rwymo dau is-uned (Ku 70 a Ku 80) i bennau pŵl neu bron yn bŵl y DNA targed (Abbasi et al., 2021), gan wasanaethu fel sgaffald i recriwtio ffactorau eraill sy'n gysylltiedig â NHEJ i safle'r anaf (Yang et al., 2020). Mae XRCC-4 a ligase DNA yn cynnwys 334 a 911 o asidau amino, yn y drefn honno, ac mae'r cymhlyg XRCC4-DNA ligase IV yn ysgogi clymu pennau DNA (Chatterjee et al., 2015). Mae ensym prosesu pen DNA, a elwir hefyd yn polynucleotide kinase 3′-ffosffad, yn ensym prosesu pen DNA. Gall gael gwared ar y grŵp 3′P mewn DNA a ffosfforyleiddio'r grŵp 5′OH yn ystod atgyweirio DSB. Mae hefyd yn cynnwys atgyweirio toriadau llinyn sengl (SSBs) gan ddefnyddio'r llwybr atgyweirio SSB (Chatterjee et al., 2015). Mae protein kinase DNA-PKcs yn brotein kinase sy'n ddibynnol ar DNA sy'n cynnwys is-uned catalytig o'r teulu PIKKs (kinasau cysylltiedig â phosphatidylinositol 3-kinase) a mwtaniad ataxia telangiectasia (ATM), yn ogystal ag ATM a ATRs cysylltiedig ag Rad3, toriadau llinyn (DSBs) a thoriadau llinyn sengl (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
Mae HDR yn fecanwaith atgyweirio mwy cywir ac addas oherwydd bod y wybodaeth yn cael ei chopïo gan ddefnyddio ffurf gyfan y deuplex DNA homologaidd, er ei fod angen presenoldeb cromatidau chwaer. Mae hyn yn digwydd yn ystod cyfnod S/G2 cylchred celloedd mamaliaid. Mae HDR yn digwydd yn bennaf mewn rhywogaethau burum, ond mae NHEJ yn hanfodol mewn mamaliaid (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Dangosir y mecanwaith atgyweirio cyflawn yn Ffigur 1.
Gan fod TNBC yn cael ei achosi gan annormaleddau genetig ac epigenetig, gall cywiro annormaleddau genomig/epigenomig malaen gan ddefnyddio CRISPR/Cas9 fod yn ddull therapiwtig rhesymol (Chen et al., 2019). Yn ogystal, gall rhai ffactorau trawsgrifio sy'n ymwneud â rheoleiddio trawsgrifio penodol i gelloedd arddangos nodweddion unigryw celloedd canser, gan awgrymu y gallai rheoleiddio trawsgrifio fod yn ddull rhagorol ar gyfer trin canser (Drost et al., 2017). Gall manteisio ar y nodweddion moleciwlaidd hyn o diwmorau, fel diffygion genetig, epigenetig a thrawsgrifio, ar gyfer datblygu cyffuriau wella canlyniadau clinigol a lleihau costau sgrinio. Mae CRISPR yn offeryn golygu genynnau posibl a all nid yn unig ganfod ac adnabod targedau genomig sy'n achosi canser, ond gellir ei ddefnyddio hefyd i olygu, atal ac addasu oncogenes yn epigenetig mewn celloedd dynol (Tabl 1) (Ahmed et al., 2021). Mae sawl sgrin CRISPR wedi'u cynnal i chwilio am enynnau sy'n gysylltiedig ag atalyddion tiwmor, oncogenes, a gwrthwynebiad i gyffuriau. Dangosir y defnydd o CRISPR/Cas9 i olygu amrywiol oncogenynnau TNBC yn Ffigur 2.
Ffigur 2. Golygu genynnau amrywiol oncogenau TNBC gan ddefnyddio CRISPR/Cas9 gan arwain at ostyngiad mewn twf tiwmor a metastasis. Mae'r oncogenau hyn yn cynnwys CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 a CXCR7, Crypto1, ROR1 ac ST8SIA, sy'n ymwneud â digwyddiad a metastasis TNBC.
Mae mudo celloedd canser, goresgyniad, a thrawsnewidiad epithelaidd-mesenchymaidd (EMT) yn gysylltiedig ag ITGA9. Mae astudiaethau blaenorol wedi dangos bod ITGA9 yn chwaraewr allweddol yn y llwybr Notch ac yn chwarae rhan ddiddorol mewn metastasis rhabdomyosarcoma (Molist et al., 2020). Yn ogystal, canfuwyd bod ITGA9 yn gysylltiedig yn agos â prognosis cleifion mewn sawl math o diwmor, gan gynnwys canser y fron (Wang Z. et al., 2019). Yn ogystal, dangosodd dadansoddiad biowybodeg o ITGA9 fod ei fynegiant mewn TNBC yn sylweddol uwch nag mewn isdeipiau eraill o ganser y fron. Mae lefelau ITGA9 uchel yn gysylltiedig â metastasis tiwmor ac ailwaelu mewn cleifion TNBC. Arweiniodd dileu ITGA9 gan CRISPR/Cas9 at briodweddau tebyg i gelloedd bonyn canser (CSC), angiogenesis tiwmor, twf tiwmor, a metastasis llai trwy hyrwyddo diraddio β-catenin mewn TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Mae Crypto-1 yn aelod o'r teulu TGF-β ac mae'n hanfodol ar gyfer embryogenesis cynnar, cynnal a chadw celloedd bonyn, a metastasis canser (Ishii et al., 2021). Hefyd yn cael ei adnabod fel Tdgf-1, mae'n brotein signalau oncogenig sydd wedi'i angori gan GPI sy'n ymwneud â rheoleiddio ffurfio'r streipen gyntefig, y mesoderm a'r endoderm, yn ogystal â sefydlu anghymesuredd chwith/dde yn natblygiad organau'r corff yn ystod embryogenesis (Zhang et al., 2021b). Yn ogystal, dangoswyd bod Cripto-1 yn ymwneud â thrawsnewidiad epithelaidd-mesenchymal (EMT) fel marcwr celloedd bonyn (Zhang et al., 2021b). Mae EMT yn hanfodol nid yn unig ar gyfer amrywiol brosesau megis datblygiad embryonig, ffibrosis ac iachâd clwyfau, ond hefyd ar gyfer goresgyniad canser a metastasis. Yn ogystal, dangoswyd bod Cripto-1 yn rhyngweithio â phedwar derbynnydd Notch ac yn gwella eu haeddfedu ôl-gyfieithiadol (Brandstadter a Maillard, 2019). Mae'n hysbys bod llwybr signalau Notch yn rhan o gynnal celloedd canser y fron dynol. Mae astudiaethau wedi dangos bod dileu Crypto-1 a achosir gan CRISPR/Cas9 yn atal twf a metastasis canser. Felly, gall Crypto-1 ddod yn darged therapiwtig pwysig ar gyfer TNBC (Castro et al., 2015).
Mae protein XCL12 a'i dderbynydd chemocine CXC (CXCR4 a CXCR7) yn chwarae gwahanol rolau mewn amlhau, twf, mudo a goresgyniad celloedd canser (Wu et al., 2015). Mae'r chemodderbynyddion hyn wedi'u cysylltu â datblygiad TNBC trwy lwybrau signalau lluosog mewn modelau in vivo ac in vitro (Wu et al., 2015). Yn ogystal, mae actifadu CXCR4 a CXCR7 yn gysylltiedig â mwy o duedd i fetastasis a prognosis gwael mewn TNBC (Karn et al., 2022). Felly, gall dileu CXCR4 a CXCR7 ddod yn enynnau targed cyffuriau effeithiol ar gyfer trin canser y fron, gan gynnwys TNBC. Astudiaeth gan Yang et al. Defnyddiodd Yang et al (2019) CRISPR/Cas9 i gyd-ddileu'r genynnau CXCR4 a CXCR7 a chanfod bod amlhau, twf, mudo a goresgyniad TNBC wedi'u hatal yn sylweddol (Yang et al., 2019).
Gwelwyd lefelau uwch o miR-3662, oncogene TNBC, mewn meinweoedd canser y fron (Yi et al., 2022). Dangoswyd bod dileu miR-3662 yn atal twf tiwmor a metastasis canser y fron in vivo ac in vitro (Agarwal a Gupta, 2021). Mae HBP-1 yn atalydd cryf o signalau Wnt/-catenin ac mae'n debygol o fod yn gyfrifol am dwf celloedd TNBC a gyfryngir gan miR-3662. Yn ddiweddar, canfu Yi et al. fod yr echelin miR-3662-HBP1 yn rheoleiddio'r llwybr signalau Wnt/-catenin mewn celloedd TNBC (Yi et al., 2022). Oherwydd ei fynegiant penodol i diwmorau, gall miR-3662 fod yn darged therapiwtig posibl ar gyfer TNBC. Felly, gall dileu miR-3662 a gyfryngir gan CRISPR/Cas9 fod yn ddull rhagorol ar gyfer datblygu cyffuriau newydd ar gyfer trin TNBC.
Mae UBR5 yn niwcleoffosffoprotein 300 kDa sydd wedi'i nodi fel rheolydd allweddol tiwmorgenesis, metastasis, ac ymateb imiwnedd mewn amrywiol ganserau (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). Adroddwyd bod UBR5 wedi'i uwchreoleiddio'n fawr mewn samplau TNBC ac yn ysgogi swyddogaeth ERα trwy ysgogi amlhau trwy ei weithgaredd ligase iwbigwitin (Bolt et al., 2015). Dangosodd astudiaethau dilyniannu exome cyfan o samplau TNBC cynradd hefyd fynegiant cynyddol o UBR5, gan awgrymu ei rôl yn natblygiad TNBC. Yn ogystal, dangosodd dileu UBR5 a yrrir gan CRISPR/Cas9 ataliad sylweddol o metastasis a thwf TNBC mewn modelau llygoden arbrofol. Ar ben hynny, adferodd cynnwys UBR5 mewn model llygoden math gwyllt ei swyddogaeth lawn, tra na welwyd yr effaith hon mewn straeniau mwtant anactifedig (Liao et al., 2017). Mae diffyg UBR5 yn gysylltiedig â mwy o apoptosis, necrosis, ac atal twf tiwmor mewn TNBC oherwydd angiogenesis gwael. Oherwydd colli UBR5, mae lledaeniad tiwmor i organau pell yn cael ei leihau, ac mae UBR5 yn achosi EMT annormal yn bennaf trwy leihau mynegiant E-cadherin (Zhang a Weinberg, 2018). Yn ddiweddar, dangoswyd bod UBR5 yn ffactor pwysig iawn mewn trawsgrifiad PDL1 a achosir gan IFN-γ mewn TNBC oherwydd ei ddiffyg gweithgaredd ubiquitineiddio E3. Datgelodd dadansoddiad trawsgrifiad RNA y gallai UBR5 gael effeithiau systemig ar enynnau sy'n gysylltiedig â'r llwybr IFN-γ a hyrwyddo trawsactifadu PDL1 trwy gynyddu lefelau actifadu RNA protein kinase (PKR) a'i drawsddygiaduron signal ac actifadyddion. trawsgrifiad 1 (STAT1) a ffactor rheoleiddio interferon 1 (IRF1). Fodd bynnag, mae gan abladiad cyfun o fynegiant UBR5 a PD-L1 a achosir gan CRISPR/Cas9 effaith therapiwtig synergaidd na'r naill rwystr na'r llall ar ei ben ei hun, gydag effeithiau dwys ar ficroamgylchedd y tiwmor (Wu et al., 2022). Felly, gall CRISPR/Cas9 fod yn offeryn pwysig i atal swyddogaeth UBR5, a thrwy hynny atal metastasis TNBC a thwf tiwmor.
Mae ROR1 yn brotein trawsbilen math I sy'n cael ei fynegi yn ystod canser a datblygiad embryonig ac mae wedi'i nodi fel protein oncoffetal (Nicholas Borcherding, 2014). Mae ymddygiad ymledol amrywiol ganserau dynol yn gysylltiedig ag uwchreoleiddio ROR1. Mae canlyniadau addawol wedi'u cael o astudiaethau in vivo ac in vitro sy'n cynnwys cyfansoddion therapiwtig sy'n targedu ROR1 (Chien et al., 2016). Mae lefelau uwch o mRNA ROR1 mewn biopsïau meinwe'r fron hefyd wedi'u cysylltu â thiwmorau'r fron tebyg i fasal (BL) ymosodol a'u mudo i rannau eraill o'r corff. Ar ben hynny, mae gorfynegiant ROR1 wedi'i nodi fel marcwr prognostig ar gyfer datblygiad TNBC (Chien et al., 2016). Fodd bynnag, byddai tawelu ROR1 gan ddefnyddio CRISPR/Cas9 i atal twf a metastasis TNBC yn strategaeth effeithiol.
Mae'r broses sialylu yn cynnwys ychwanegu asid sialig at glycoconjugates, sy'n cael ei gatalyddu gan sialyltransferases (STs). Mae ST8SIA1 yn perthyn i'r teulu ST ac mae'n chwarae rhan bwysig ym pathogenesis amrywiol afiechydon fel lewcemia lymffocytig a chanser y colon a'r rectwm (Chang et al., 2018). Mae dadansoddiad dilyniant RNA yn dangos bod ST8SIA1 wedi'i fynegi'n uchel ym meinwe'r fron mewn cleifion TNBC ac mae'n gysylltiedig yn gadarnhaol â mwtaniadau yn y genyn atalydd tiwmor p53, a all gyfrannu at pathogenesis TNBC (Battula et al., 2017). Yn ogystal, mae ST8SIA1 yn ymwneud â metastasis ac ailddigwyddiad TNBC, gan awgrymu ei fod yn chwarae rhan bwysig yn natblygiad TNBC. Mewn model in vitro o TNBC, dangoswyd bod dileu ST8SIA1 gan CRIPSR/Cas9 yn rhwystro twf a metastasis (Battula et al., 2017). Mae hyn yn awgrymu y gallai CRISPR/Cas9 fod yn offeryn pwysig ar gyfer atal swyddogaeth yr oncogene ST8SIA1 wrth drin TNBC.
Mae NAT1 yn ensym metabolaidd sy'n cataleiddio ffurfio cyfansoddion xenobiotig cam II ac mae'n cael ei fynegi ym mron pob meinwe ddynol. Gall NAT1 ddefnyddio'r cyd-ffactor ffolad i dargedu asetyl-CoA (asetyl-CoA) hyd yn oed yn absenoldeb y swbstrad amin aromatig (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Mae astudiaethau wedi dangos bod NAT1 yn rheoleiddio swyddogaeth matrics metalloproteinase 9 (MMP9) mewn modelau celloedd canser y fron ac yn amddiffyn rhag rhywogaethau ocsigen adweithiol (ROS) yn ystod newyn glwcos (Wang et al., 2018). Dangoswyd bod dileu NAT1 yn atal y cymhlyg pyruvate dehydrogenase, gan arwain at gamweithrediad mitocondriaidd (Wang L. et al., 2019). Yn ogystal, mae amryw o adroddiadau eraill wedi dangos y gall ataliad NAT1 gan ddefnyddio moleciwlau bach a thawelu siRNA leihau ymledolrwydd ac amlhau celloedd canser y fron (Stepp et al., 2018). Yn ddiweddar, defnyddiwyd CRISPR/Cas9 i atal NAT1 yn y llinell gelloedd canser y fron MDA-MB-231, gan effeithio ar fetaboledd cellog yn dibynnu ar ei lefel mynegiant. Dangosodd yr astudiaeth hon hefyd fod NAT-1 yn hanfodol ar gyfer dilyniant a metastasis TNBC (Carlisle et al., 2020).
Mae trawsgrifiad cydlynol oncogenau yn cael ei reoleiddio gan uwch-wellawyr, ffactorau trawsgrifio a chyd-ffactorau (Hnisz et al., 2015). Yn ogystal, mae angen grŵp o ginasau sy'n ddibynnol ar seiclin (CDKs), fel CDK7, CDK8, CDK9, CDK12, a CDK13, ar gyfer rheoleiddio trawsgrifio. Yn eu plith, mae CDK7 yn ymwneud â ffosfforyleiddiad RNA polymerase II, sy'n bwysig iawn ar gyfer cychwyn ac ehangu trawsgrifio oncogen ym pathogenesis TNBC. Mewn astudiaeth arloesol, ataliodd dileu CDK7 gan CRISPR/Cas9 TNBC, gan ddangos bod pathogenesis TNBC yn ddibynnol ar CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Mae astudiaethau wedi dangos y gall mwtaniadau yn MYC ac RBP (protein rhwymo RNA) arwain at apoptosis, tra nad yw mwtaniadau genyn sengl yn MYC neu RBP yn effeithio ar dwf celloedd canser (Einstein et al., 2021). Mae mwy na 1000 o RBPs yn y genom dynol wedi'u sgrinio gan ddefnyddio llyfrgell sy'n seiliedig ar CRISPR/Cas9. Yn eu plith, canfuwyd bod 57 o RBPs yn hanfodol ar gyfer twf celloedd canser â lefelau MYC uchel iawn (Wheeler et al., 2020). Yn ogystal, mae YTHDF2 yn bwysig ar gyfer cynnal twf celloedd TNBC ac yn lleihau faint o drawsgrifiadau methyledig yn ystod trawsgrifio a chyfieithu lefel uchel mewn celloedd canser â mynegiant MYC uwch. Yn ogystal, nid yw YTHDF2 yn hanfodol ar gyfer celloedd canser, sy'n llai dibynnol ar lefelau MYC uchel i ymestyn goroesiad cleifion TNBC (Einstein et al., 2021), gan awgrymu y gallai fod yn darged therapiwtig posibl ar gyfer cyffuriau a all oresgyn TNBC.
Mae proteinau bys sinc (ZNFs) yn ffurfio tua 1% o gyfanswm y genom dynol. Mae astudiaethau wedi dangos y gall ZNF reoleiddio amlhau celloedd mewn amrywiol ganserau, fel canser yr afu, canser y fron a chanser y colon a'r rhefrwm (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Defnyddiwyd llyfrgelloedd a gynhyrchwyd gan ddileu CRISPR i sgrinio amrywiol enynnau atalydd tiwmor (TSGs) mewn celloedd canser y fron (Shalem et al., 2014). Ers hynny, mae astudiaeth drawsgrifiadol o gelloedd canser y fron sydd wedi'u dileu o CRISPR/Cas9 ZNF319 wedi dangos bod ZNF319 yn enyn atalydd tiwmor sy'n lleihau amlhau canser y fron ac felly'n ymwneud â amrywiol fecanweithiau signalau posibl a swyddogaethau biolegol eraill (Wang L. et al., 2022).
Mae ferroptosis yn fath o farwolaeth celloedd wedi'i raglennu sy'n ddibynnol ar bresenoldeb haearn. Gwyddys bod presenoldeb perocsidau lipid yn dylanwadu ar ddatblygiad ferroptosis. Yn ogystal, adroddwyd bod PKCβII yn arddangos perocsidiad lipid cynnar, ac mae perocsidiad lipid cynyddol yn gysylltiedig â ferroptosis. Datgelodd sgrinio llyfrgell o atalyddion kinase a gyfryngir gan CRISPR/Cas9 fod PKCβII yn rhan o'r broses o berocsidiad lipid, sy'n hanfodol ar gyfer ferroptosis mewn celloedd MDA-MB-231 (Zhang et al., 2022). Felly, mae hyn yn awgrymu y gallai dileu PKCβII gan CRISPR/Cas9 fod yn darged genyn atalydd tiwmor posibl ar gyfer trin clefydau sy'n gysylltiedig â ferroptosis (Zhang et al., 2022).
Credir bod ymwrthedd i gyffuriau yn gyfrifol am tua 90% o farwolaethau mewn cleifion canser ac mae'n un o'r prif heriau mewn triniaeth canser (Bukowski et al., 2020). Mae'r canlyniadau'n dangos bod nifer ddigonol o enynnau sy'n gysylltiedig ag all-lif cyffuriau, atgyweirio DNA, apoptosis ac amrywiol lwybrau signalau celloedd yn gysylltiedig â gwrthwynebiad i gyffuriau (Haider et al., 2020). Yn eu plith, mae sawl genyn wedi'u targedu gan offer CRISPR/Cas9 ac wedi dangos canlyniadau addawol wrth leihau ymwrthedd i gyffuriau a chynyddu effeithiolrwydd triniaethau gwrth-ganser (Vaghari-Tabari et al., 2022). Yn ogystal, mae llyfrgelloedd sgrinio cnoi allan genynnau CRISPR/Cas9 trwybwn uchel wedi'u cysylltu â newid swyddogaeth targedau genynnau ymwrthedd i gyffuriau posibl (Shalem et al., 2015). I nodi genynnau gwrthiant paclitaxel, defnyddiwyd dilyniannu RNA ynghyd â sgrinio llyfrgell sgRNA genom-gyfan i nodi wyth genyn ymgeisydd, gan gynnwys histone deacetylase 9 (HDAC9), sy'n gysylltiedig â gwrthiant cyffuriau mewn cleifion â TNBC rheolaidd (B et al., 2020). Mewn astudiaeth arall, gwelwyd cynnydd mewn mynegiant diserine/threonine a thyrosine protein kinase (DSTYK) yn ystod goroesiad cleifion TNBC a gafodd eu trin â chyffuriau gwrthganser. Ar ben hynny, gwellodd dileu DSTYK a gyfryngwyd gan CRISPR/Cas9 apoptosis celloedd canser sy'n gwrthsefyll cyffuriau yn sylweddol in vitro (celloedd SUM102PT a chelloedd MDA-MB-468) a model TNBC in vivo (Ogbu et al., 2021).
Er bod gan TNBC actifadu annormal o'r llwybr MAPK, mae effaith glinigol therapïau wedi'u targedu at MEK yn wael. Datgelodd sgrin llyfrgell genomig CRISPR/Cas9 fod ataliad PSMG2 (chaperone cydosod proteome 2) yn sensitifio celloedd TNBC BT549 ac MB468 i'r atalydd MEK AZD6244. Newidiodd cwympo PSMG2 gan CRISPR/Cas9 swyddogaeth proteasom arferol, gan arwain at ddadosod PDPK1 a gyfryngir gan awtoffagiaeth, a thrwy hynny wella celloedd tiwmor ymhellach mewn modelau llygoden TNBC a ysgogwyd gan AZD6244 (atalydd MEK) ac MG132 (atalydd proteasom). Felly, gellir rhoi atalyddion proteasom a MAP kinase (MEK) yn synergaidd i leihau amlhau celloedd tiwmor (Wang X. et al., 2022).
Defnyddiwyd CRISPR/Cas9 hefyd i sgrinio am golli swyddogaeth genynnau sy'n arwain at wrthwynebiad i TNBC (Shu et al., 2020). Esboniodd Ge et al fecanwaith ymwrthedd cyffuriau celloedd canser a gafodd eu trin â JQ1, atalydd bromodomain BET (BBDI), mewn TNBC. Gan ddefnyddio CRISPR/Cas9, fe wnaethant ganfod bod dileu'r genyn rb1 wedi achosi i TNBC ddod yn wrthwynebus i'r cyffur gwrth-ganser JQ1. Felly, mae swyddogaeth rb1 yn bwysig yn yr ymateb i gyffuriau JQ1 mewn TNBC. Fe wnaethant hefyd adrodd bod paclitaxel yn atalydd CDK4/6 kinase/microtubule, a gall ei gyfuniad â BBDIs fel JQ1 ddarparu ymatebion therapiwtig addawol i TNBC sy'n gwrthsefyll cyffuriau (Ge et al., 2020).
Adroddwyd bod tirwedd drawsgrifio RNA hir nad yw'n codio (lncRNA) yn gyfrifol am wrthwynebiad i therapi neoadjuvant mewn TNBC. Mae'r astudiaeth hon yn dangos bod pum trawsgrifiad lncRNA MALAT1 gwahanol yn cael eu mynegi'n uchel mewn TNBC. Yn ogystal, cynyddodd dileu MALAT1 a gyfryngwyd gan CRISPR/Cas9 sensitifrwydd celloedd TNBC BT-549 i paclitaxel a doxorubicin, gan awgrymu rôl bosibl ar gyfer ymwrthedd MALAT1 mewn TNBC (Shaath et al., 2021).
Mae mwtaniadau yn BRCA1 (BRCA1m) yn heterogenaidd ac felly'n anodd eu canfod. Gall targedu PARP1 (poly(ADP-ribose) polymerase), partner angheuol synthetig BRCA1, gynyddu cemegsensitifrwydd cyffuriau TNBC. Gan ddefnyddio CRISPR/Cas9, cynyddodd dileu PARP1 sensitifrwydd cyffuriau gwrthganser fel doxorubicin, gemcitabine a docetaxel i gelloedd TNBC mwtant mBRCA1, gan awgrymu bod PARP1 hefyd yn ymwneud ag ymwrthedd i gyffuriau yn TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). . Mae'n hysbys bod mwtaniadau yn y genynnau atalydd tiwmor BRCA1 neu BRCA2 yn cynyddu'r tebygolrwydd o ddatblygu canser y fron mewn pobl. Mae trin y cleifion hyn yn gofyn am ddefnyddio atalyddion PARP. Yn ogystal, dangoswyd y gall dileu'r ffactor achub niwcleotid DNPH1 gan ddefnyddio CRISPR/Cas9 gael gwared ar y niwcleotid gwenwynig 5-hydroxymethyldeoxyuridine (hmdU) monoffosffad, a thrwy hynny wella ymateb celloedd sy'n ddiffygiol o ran BRCA i sensitifrwydd i atalyddion PARP (Fugger). et al., 2021). Felly, gall atalyddion CRISPR/Cas9 a PARP1 ddod yn strategaeth driniaeth bwysig ar gyfer TNBC.
Mae'r genyn glycoprotein treiddiol (P-gp) yn enyn ymwrthedd i aml-gyffuriau sydd fel arfer yn cael ei uwchreoleiddio mewn tua 41% o'r holl TNBC (Sun et al., 2020). Mae all-lif cyffuriau a achosir gan P-gp wedi'i nodi fel rheolydd allweddol ymwrthedd i gyffuriau mewn canser y fron. Mae atalyddion P-gp wedi dangos sensitifrwydd cynyddol i gyffuriau gwrthganser mewn canser y fron (Famta et al., 2021). Felly, gall abladiad neu atal P-gp ac atalyddion P-gp a gyfryngir gan CRISPR/Cas9 fod yn ddulliau pwysig iawn i oresgyn ymwrthedd i gyffuriau mewn TNBC.
Mae'n hysbys bod cludwr casét rhwymo ATP G2 (ABCG2) yn achosi ymwrthedd i gyffuriau mewn TNBC (Palasuberniam et al., 2015), er nad oes unrhyw adroddiadau ar hyn o bryd ar y berthynas rhwng tawelu CRISPR/Cas9 ac ABCG2 ac anactifadu genynnau atalydd tiwmor. Gall PTEN wella actifadu ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Felly, gall defnyddio CRISP/Ca9 i gael gwared ar ABCG2 a'i gyfuno ag atalydd ABCG2 fod yn driniaeth addas i oresgyn ymwrthedd i gyffuriau mewn TNBC. Mae Tabl 2 yn sôn am CRISPR/Cas9 yn targedu pob genyn ymwrthedd.
Tabl 2. Mae CRISPR/Cas9 yn targedu amrywiol enynnau ymwrthedd TNBC i wneud celloedd yn sensitif i gyffuriau gwrthganser.
Mae llyfrgelloedd CRISPR/Cas9 yn offer posibl ar gyfer sgrinio mwtaniadau genynnau sy'n gysylltiedig â pathogenesis canser (Chan et al., 2022). Mae'r dull sgrinio hwn yn cynnwys pedwar cam megis (a) adeiladu llyfrgell, (b) trawsgludiad lentiviral, (c) sgrinio ffenoteipig, a (d) dadansoddi genynnau targed. Er bod gan TNBC actifadu annormal o'r llwybr MAPK, mae prognosis clinigol therapi wedi'i dargedu MEK ar gyfer cleifion TNBC sy'n cario mwtaniadau mewn genynnau atalydd tiwmor fel PTEN, RB1, a TP53 yn wael iawn.
Yn ogystal, profodd sgrinio dileu genynnau gan ddefnyddio CRISPR/Cas9 y moleciwl mwyaf grymus a dethol, dehydrocatrol, sy'n doreithiog mewn dyfyniad blodau a dail Guatemala, er mwyn deall effaith dehydrocatrol ar MDA-MB-231. Mecanweithiau cytotocsinedd celloedd dethol. Nodweddion coesyn mesenchymal isdeipiau TNBC. Datgelodd y sgrin hon sy'n seiliedig ar CRISPR/Cas9 hefyd fod HSD17B11, genyn sy'n amgodio 17β-hydroxysteroid dehydrogenase math 11, wedi'i fynegi'n fawr mewn celloedd MDA-MB-231 ac yn arwain at dehydrofalcarinol sy'n benodol i gelloedd MDA-MB-231 (Grant et. al., 2020). Felly, mae hyn yn awgrymu bod gan sgrinio genomig CRISPR/Cas9 botensial mawr wrth nodi'r mecanweithiau sy'n sail i briodweddau gwrthganser cyfansoddion naturiol posibl.
Yn ogystal, astudiwyd pa mor agored i niwed yw TNBC i ganser gan ddefnyddio sgrin CRISPR/Cas9 in vivo diduedd ar draws y genom, a ddangosodd gysylltiad rhwng llwybrau oncogenig ac atalyddion tiwmor. Adroddwyd bod cydrannau allweddol y llwybrau mTOR a Hippo yn chwarae rolau pwysig mewn rheoleiddio tiwmorau mewn TNBC. Yn ogystal, mae astudiaethau wedi dangos bod ataliad ffarmacolegol o oncoprotein mTORC1/2 ac YAP yn atal pathogenedd TNBC yn effeithiol gan ddefnyddio model synergedd matrics cyffuriau in vitro a xenograftau sy'n deillio o gleifion in vivo. Ar ben hynny, mae ataliad mTORC1/2 a gyfryngir gan Torin-1 yn gwella macropinocytosis, tra bod ataliad YAP a achosir gan verteporfin yn arwain at farwolaeth celloedd TNBC. Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn tynnu sylw at bŵer a chadernid sgrinio CRISPR in vivo ar draws y genom i nodi triniaethau newydd ac effeithiol ar gyfer TNBC (Dai et al., 2021).
Mae camreoleiddio'r system imiwnedd yn ffactor pwysig mewn tiwmorgenesis. Mae celloedd canser yn osgoi clirio imiwnedd trwy osgoi mecanweithiau amddiffyn, gan gynnwys ymyrryd â gweithgaredd celloedd imiwnedd yn y microamgylchedd tiwmor a pheryglu'r system imiwnedd. Felly, gall datblygu system imiwnedd well fod yn ddull allweddol o ymladd tiwmorau. Mae defnyddio addasu genynnau sy'n seiliedig ar CRISPR/Cas9 yn mynd i'r afael â sawl mater sy'n gysylltiedig â chamweithrediad imiwnedd o wahanol safbwyntiau. Defnyddiwyd CRISPR/Cas9 i wella imiwnedd gwrth-tiwmor yn erbyn canser y fron trwy'r llwybrau canlynol (Ffigur 3).
Ffigur 3. Mae imiwnotherapi CRISPR/Cas9 yn targedu celloedd TNBC. Mae colli CDK5 a dileu PDL1 a CD155 yn gwella'r system imiwnedd. Yn yr un modd, mae colli A2AR a dileu TAAs fel HER2, mwcin 1 a TEM8 wedi cynyddu effeithlonrwydd celloedd CAR-T wrth ladd celloedd canser. Mae sgrinio celloedd T wedi'i yrru gan CRISPR/Cas9 wedi dangos bod amharu ar kinase p38 yn gwella gweithgaredd gwrth-diwmor celloedd T. Mae celloedd T wedi'u haddasu gan CRISPR/Cas9 yn cynyddu mynegiant TCR (derbynydd celloedd T), gan arwain at gelloedd T yn cael gweithgaredd gwrth-diwmor.
Nod imiwnotherapi yw ysgogi'r system imiwnedd i ymosod ar gelloedd canser. Mae gor-fynegiant proteinau pwynt gwirio imiwnedd fel arfer yn atal adweithiau hunanimiwn ond gall helpu canserau i'w hosgoi (Topalian et al., 2015). Mae'r proteinau hyn yn atal adweithiau imiwnedd trwy rwymo i dderbynyddion ar wyneb celloedd imiwnedd. Mae proteinau pwynt gwirio lluosog (megis CD155 a PD-L1) yn targedu'r derbynnydd PD-1 ar gelloedd imiwnedd ac yn cael eu mynegi mewn canser y fron, yn enwedig TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). Gall dileu PD-L1 neu ei dderbynydd gan ddefnyddio CRISPR/Cas9 ysgogi'r system imiwnedd i ymosod ar diwmorau TNBC (Yahata et al., 2019). Yn ogystal, dangoswyd bod lleihau mynegiant PD-L1 trwy ddileu CDK5 a gyfryngir gan CRISPR/Cas9 yn atal twf tiwmor in vitro ac in vivo (Deng et al., 2020). Mae atal twf mewn modelau in vitro ac in vivo o ganser y fron yn awgrymu y gallai gostyngiad mewn CD155 a gyfryngir gan shRNA gael effaith therapiwtig ar ganser y fron (Gao et al., 2018).
Mae celloedd T CAR yn mynegi CARau sy'n adnabod antigenau sy'n gysylltiedig â thiwmorau (TAAs) a gallant ddefnyddio tynnu proteinau pwynt gwirio i wella eu gweithgaredd (Li C. et al., 2020). Mae amryw o dargedau posibl ar gyfer therapi celloedd T CAR mewn canser y fron, gan gynnwys sawl TAA fel HER2, mucin1, a TEM8 (Bajgain et al., 2018). Mae tystiolaeth bod celloedd T CAR sy'n targedu mesothelin (wedi'i or-fynegi mewn celloedd TNBC BT-459) yn fwy effeithiol yn erbyn canser pan gaiff PD-1 ei dynnu allan gan ddefnyddio CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Fodd bynnag, mae ynysu celloedd T oddi wrth gleifion ac yna eu golygu ex vivo yn broses llafurddwys ac amser-gymerol. Er y gall celloedd T cyffredinol leihau gofynion ynysu, dylid tynnu celloedd T rhoddwr sy'n mynegi antigen leukocyte dynol dosbarth I (HLA) a derbynnydd celloedd T (TCR) i atal annormaleddau impiad-yn-erbyn-gwesteiwr (Ren et al., 2017, 2017a). Gan ddefnyddio CRISPR/Cas9, gall HDR ddileu TCR a HLA ar yr un pryd a dileu'r genyn sy'n amgodio CAR. Mae astudiaethau wedi dangos y gellir defnyddio CRISPR/Cas9 i gyflwyno CARau gwrth-CD19 i'r locus TCR, a thrwy hynny gynhyrchu CARau yn effeithlon heb ddihysbyddu celloedd T (Dimitri et al., 2022). Mae technolegau amlblecs wedi'u datblygu i gynhyrchu celloedd T CAR allogeneig trwy ddileu TCR, beta-2-microglobulin (B2M), is-uned HLA-I a phroteinau eraill fel PD-1 a CTLA-4 ar yr un pryd, a allai fod â phriodweddau gwrth-ganser gwell yn erbyn TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
Gallai defnyddio CRISPR/Cas9 wella effeithiolrwydd celloedd CAR-T. Gwyddys bod gan adenosin briodweddau imiwnosupresitive a gall leihau imiwnedd gwrthganser trwy rwystro swyddogaeth celloedd T ac actifadu derbynyddion adenosin A2A (A2AR) (Vigano et al., 2019). Gwellodd tawelu A2AR gan ddefnyddio CRISPR/Cas9 effeithiolrwydd celloedd CAR-T in vivo yn sylweddol (Giuffrida et al., 2021). Gwyddys bod celloedd T yn arddangos amrywiol nodweddion ffenoteipig megis ehangu cellog, gwahaniaethu, straen ocsideiddiol a straen genomig. Datgelodd sgrinio celloedd T yn seiliedig ar CRISPR/Cas9 amhariad ar 25 o ginasau derbynnydd celloedd T gwahanol. Yn eu plith, dangoswyd bod dileu p38 kinase yn gwella gweithgaredd gwrth-diwmor celloedd T, gan nodi bod p38 kinase yn rheolydd allweddol o reoleiddio celloedd CAR-T (Gurusamy et al., 2020).
Gellir addasu celloedd T yn enetig gan ddefnyddio CRISPR/Cas9 i gynhyrchu celloedd TCR sydd â mynegiant uchel. Mae trosglwyddo celloedd T wedi'u haddasu'n enetig i gleifion wedi dangos gweithgaredd gwrthganser cryfach na chelloedd T mewndarddol. Felly, gall celloedd TCR mewndarddol gystadlu â celloedd T wedi'u haddasu'n enetig mewn cleifion, a all effeithio ar botensial imiwnotherapi canser. I oresgyn y broblem hon, gall defnyddio CRISPR/Cas9 i gael gwared ar TCR-β mewndarddol mewn celloedd derbynnydd ac yna trosglwyddo celloedd TCR-β i gleifion canser arddangos ymatebion imiwnedd gwrthganser gwell heb yr angen am gystadleuaeth rywiol mewndarddol gyda TCR (Fan et al. 2018). Felly, ac eithrio celloedd T wedi'u haddasu gan CRISPR, mae celloedd TCR fil gwaith yn fwy sensitif i antigenau tiwmor na chelloedd T arferol wedi'u trawsdwyso gan TCR. Yn ogystal, mewn amrywiol lewcemia, mae celloedd T wedi'u newid a gynhyrchir gan γδ TCR+ CRISPR yn arddangos mynegiant uwch o gelloedd T CD4+ a CD8+ na throsglwyddiad TCR safonol (Legut et al., 2018). Felly, gall celloedd T wedi'u haddasu a gynhyrchir gan CRISPR/Cas9 fod yn ddull imiwnotherapi effeithiol i oresgyn TNBC.
Moleciwlau adlyniad celloedd yw integrins sy'n bresennol mewn trawsbilennau cellog ac yn hyrwyddo rhwymo celloedd i'r matrics allgellog (ECM) (Hamidi ac Ivaska, 2018). Mae camreoleiddio integrins yn gysylltiedig â datblygiad a mudo canser trwy newid y matrics allgellog, gan arwain at oroesiad celloedd canser yn y cylchrediad (Hamidi ac Ivaska, 2018). Mae dileu integrin a gyfryngir gan CRISPR/Cas9 yn arafu dilyniant tiwmor, metastasis a gwladychu mewn TNBC. Adroddwyd bod dileu integrin a5 (ITGA5) yn lleihau mudo a dilyniant celloedd mewn canserau eraill fel canser yr ysgyfaint (Ju et al., 2017), gan awgrymu y gallai integrin a5 hefyd fod yn ffactor allweddol ym pathogenesis TNBC.
Mae cynhyrchu llygod knockout gan ddefnyddio dulliau celloedd bonyn embryonig (ES) traddodiadol yn broses llafur-ddwys, amser-gymerus, ac aneffeithlon. Mae'n cymryd misoedd a blynyddoedd i dargedu celloedd ES trwy ailgyfuno homologaidd, bridio llygod chimerig, ac yna eu croesi â llygod heterosygaidd i gynhyrchu epil homosygaidd. Mae angen croesfridio cymhleth i greu llygod â mwtaniadau genetig lluosog. Fodd bynnag, mae llawer o broblemau wedi codi wrth ddefnyddio llygod a gynhyrchwyd trwy abladiad celloedd ES gan ddefnyddio CRISPR/Cas9 neu drwy ficro-chwistrellu cydrannau CRISPR/Cas9 i wyau wedi'u ffrwythloni un gell. Er enghraifft, mae cyflwyno newidiadau yn aml yn digwydd mewn loci bialelig ac nid yw'n benodol i enynnau. Adroddwyd yn ddiweddar y gall celloedd ES gan ddefnyddio technoleg CRISPR/Cas9 fewnosod mwtaniadau bialelig ar yr un pryd mewn hyd at 5 genyn (Nishizono et al., 2021). At y diben hwn, trawsffectiwyd mRNA Cas9 a phum gRNA penodol i enynnau ar yr un pryd i gelloedd ES. Mae hyn yn tynnu sylw at addewid ac effeithiolrwydd y weithdrefn hon, er y gallai'r mwtaniadau hyn fod wedi'u trosglwyddo pan gafodd llinellau sylfaenwyr eu bridio i gynhyrchu llygod knockout pum gwaith. Mae'r astudiaeth hefyd yn adrodd am ddarganfyddiad annisgwyl: nid oes angen celloedd ES mwyach i greu llygod wedi'u haddasu'n enetig. Yn lle hynny, i gael gwared ar gynhyrchion genynnau penodol, chwistrellwyd mRNA a gRNA Cas9 i embryonau cam un gell. O ganlyniad, crëwyd llinellau sylfaenwyr knockout y gellir eu defnyddio'n ddamcaniaethol i astudio canlyniadau dileu genynnau mewn llygod (Qin et al., 2016). Felly, mae CRISPR/Cas9 yn caniatáu creu llygod trawsgenig i drin TNBC am gost is na pheirianneg enetig draddodiadol. Gan ddefnyddio'r system CRISPR/Cas, datblygwyd model llygoden knockout newydd a all gyflwyno mwtaniadau pwynt yn llwyddiannus mewn un neu fwy o enynnau endogenaidd mewn TNBC. Yn seiliedig ar y cysyniad hwn, gellir datblygu modelau anifeiliaid o TNBC hefyd gan ddefnyddio dileu BRCA1 a p53 a gyfryngir gan CRISPR/Cas9, gan arwain at golli atgyweirio HR, ansefydlogrwydd genomig, a ffenoteipiau mwtant (Annunziato et al., 2020).
Ar hyn o bryd, defnyddir amrywiol ddulliau fel mamograffeg, delweddu cyseiniant magnetig (MRI) ac uwchsain i wneud diagnosis o TNBC. Fodd bynnag, mae gan y dulliau hyn rai cyfyngiadau. Defnyddir mamograffeg i wneud diagnosis o feinwe'r fron leol yn hytrach na metastasisau, lle mae celloedd canser wedi mudo i organau eraill. Nid yw uwchsain yn ddull dibynadwy ar gyfer gwneud diagnosis o TNBC (Chen a Lee-Felker, 2023). Mae gan MRI sensitifrwydd uwch nag uwchsain a mamograffeg, ond mae ei gywirdeb diagnostig yn gyfyngedig (Sha a Chen, 2022). Mae biopsi meinwe yn ffordd ymledol o adnabod celloedd canser. Fodd bynnag, mewn rhai achosion, gall biopsi fethu meinwe ganseraidd os yw'r nodwydd yn crwydro i ffwrdd o'r ardal o ddiddordeb. Yn ogystal, mae'n ddrud iawn a gall fod yn drawmatig i'r claf. Mae TNBC yn fath heterogenaidd o ganser, felly efallai na fydd biopsi yn darparu digon o wybodaeth am y math o ganser. Felly, mae angen dull diagnostig dibynadwy newydd ar frys ar gyfer canfod TNBC. Gall CRISPR/Cas9 wasanaethu fel dewis arall hynod sensitif a lleiaf ymledol ar gyfer gwneud diagnosis o ganser y fron. I'r perwyl hwn, gellir defnyddio strategaethau sy'n seiliedig ar CRISPR/Cas9 i wella dulliau PCR ar gyfer diagnosio TNBC. Yn gyntaf, defnyddir proteinau Cas9 a cpf1 system CRISPR i gael gwared ar DNA amhenodol, ac yna gall y ddau brotein hyn (Cas9 a cpf1) adnabod y dilyniant PAM cyn rhwymo i'r DNA targed (Deepak Singh et al., 2021). Felly, gall PCR nodi mwtaniadau sy'n gysylltiedig â datblygiad canser. Mae sawl astudiaeth wedi mabwysiadu'r strategaeth hon sy'n seiliedig ar CRISPR i ganfod gwahanol fwtaniadau mewn gwahanol ganserau (Safari et al., 2019). Felly, gall dulliau PCR sy'n seiliedig ar CRISPR leihau dibyniaeth diagnosis TNBC ar ddulliau ymledol fel imiwnohistochemeg sy'n seiliedig ar fiopsi.
Mae newidiadau genoteipig mewn rheoleiddio derbynyddion hormonau hefyd wedi'u dangos mewn TNBC (Chen a Russo, 2009). Gall strategaethau PCR sy'n seiliedig ar CRISPR/Cas9 gan ddefnyddio microarrays ar gyfer diagnosteg pwynt gofal fonitro'r mwtaniadau hyn yn effeithiol (Hajian et al., 2019). Gallai hefyd roi gwybodaeth berthnasol i ddarparwyr gofal iechyd am fwtaniadau penodol mewn cleifion TNBC, a allai helpu i wella eu cwrs triniaeth. Fodd bynnag, mae cyfyngiadau ar y dechneg gyfunol hon. Felly, mae angen ymdrechion ymchwil helaeth cyn y gellir defnyddio'r dull CRISPR/Cas-PCR hwn mewn gofal iechyd ar gyfer diagnosis o TNBC (Yang et al., 2019).